磁固相萃取與高效液相色譜法聯(lián)用測定蜂蜜中的苯酚殘留量

張曉敏， 于有偉， 范哲鋒

山西師范大學化學與材料科學學院， 山西 臨汾 041000

0 引言

蜂蜜是一種有益健康的天然產(chǎn)品，具有豐富的營養(yǎng)成分，如葡萄糖、氨基酸、礦物質、酶、維生素和有機酸等[1].此外，蜂蜜具有抗氧化，增強免疫力等生物活性，可以調節(jié)生理功能，抵抗衰老[2].因此，蜂蜜在人們的日常生活中廣泛地出現(xiàn)，同時其質量安全問題也越來越受到人們的關注.苯酚常被用作驅蟲劑，也可以用來驅蜂，驅使蜜蜂快速集中于花叢采集蜂蜜,這種方法成本低而且有效，已被許多養(yǎng)蜂人廣泛應用[3，4].然而當苯酚濃度累積到一定程度時會導致慢性中毒,因此,檢測蜂蜜中苯酚殘留量是很有必要的.

目前用于檢測蜂蜜中苯酚的方法，主要有高效液相色譜法(HPLC)[4～8]和氣相色譜法(GC)[9，10]，這些方法一般都比較煩瑣、耗費時間.因此，創(chuàng)建一個簡單，有效的檢測方法至關重要.由于蜂蜜樣品基質復雜[11]，待測苯酚含量低，所以在儀器分析之前有必要進行分離富集.磁固相萃取，操作簡單,避免了繁瑣的過濾或離心過程，被廣泛應用于食品樣品的前處理.

本文合成了氧化石墨烯修飾的磁性納米復合材料作為萃取劑，結合高效液相色譜法，檢測蜂蜜中的苯酚殘留量，結果表明該方法靈敏度高、檢出限低，具有環(huán)保、成本低等特點.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

磁性氧化石墨烯復合材料根據(jù)本課題組已發(fā)表的論文制備[12]；氨水和檸檬酸購自天津光復化工公司；色譜級甲醇購自國藥集團化學試劑有限公司；苯酚標準品購自天津科密歐化學試劑有限公司；實驗用水均為美國Milli-Q所制得的超純水.

Varian 640傅里葉變換紅外光譜儀(美國瓦里安公司)；Agilent 1260 LC高效液相色譜儀(美國安捷倫公司).配置為1260 QuatPump，G1314B紫外檢測器，ZORBAX SB-C18柱(4.6×150 mm，5 μm).色譜條件如下：流動相為甲醇和水(30∶70，V/V)，流速為1.0 mL / min，紫外檢測波長為273 nm，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃.

1.2 樣品預處理

蜂蜜樣品購自山西臨汾當?shù)氐酿B(yǎng)蜂人，并儲存在冰箱中待用.取25 g蜂蜜樣品，與去離子水混合，稀釋至100 mL，用檸檬酸調節(jié)樣品溶液的pH值，并超聲處理幾分鐘以形成均勻的溶液，最后用0.45 μm尼龍濾膜過濾.

1.3 磁固相萃取(MSPE)程序

將25 mg磁性氧化石墨烯復合材料加入含有100 mL樣品溶液的錐形瓶中，然后使用恒溫水浴振蕩器，在室溫下將混合物振蕩5 min后，將磁鐵置于錐形瓶底部靜置，使磁性吸附劑與上清液分離.棄去上清液后，除去磁鐵，加入1 mL堿性甲醇(含0.01 M氨水)作為洗脫液，室溫下振蕩4 min后，通過外加磁場，收集甲醇上清液后經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾，并將10 μL洗脫液注入高效液相色譜儀中進行分析.

2 結果與討論

2.1 磁性材料的表征

圖1為磁性氧化石墨烯復合材料的FT-IR譜圖.在566 cm-1處的峰是Fe—O的特征吸收峰，1 080 cm-1處的Si—O伸縮振動峰表明Fe3O4納米顆粒上包覆了SiO2.1 404 cm-1處的振動峰歸屬于苯環(huán)的骨架振動，在1 628 cm-1處的峰歸屬于肽鍵的特征吸收峰.上述結果表明氧化石墨烯被修飾到Fe3O4納米顆粒的表面上，材料合成.

2.2 磁固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 吸附劑的用量

吸附劑的用量對于萃取效率有著顯著的影響.

圖1 磁性氧化石墨烯復合材料的紅外表征圖
Fig.1 Fourier-transform infrared spectroscopy of graphene-loaded magnetite nanocomposite

在5 mg～35 mg范圍內(nèi)研究了吸附劑的用量對苯酚萃取效率的影響.結果表明，當吸附劑的用量為25 mg時，萃取效率達到最大，用量超過25 mg時，萃取效率沒有明顯變化.因此，在隨后的實驗中選用25 mg吸附劑.

2.2.2 萃取時間和洗脫時間

為了使吸附劑在短時間內(nèi)能最大程度地吸附苯酚，在1 min～13 min范圍內(nèi)評估了萃取時間對萃取效率的影響.實驗表明在5 min時，萃取效率達到最大值，苯酚的吸附過程達到平衡.因此，選擇5 min作為最佳萃取時間.洗脫時間在1 min～6 min范圍內(nèi)進行了優(yōu)化.結果表明，在4 min時，苯酚的萃取效率達到最大，不再增加，因此最佳洗脫時間為4 min.

2.2.3 溶液的pH值

在磁固相萃取過程中，溶液的pH值是影響萃取效率的關鍵因素之一.實驗中，通過用氨水和檸檬酸調節(jié)pH值范圍為2到8進行優(yōu)化.結果表明，當pH值為3時，萃取效率最大.

2.2.4 樣品體積

為了獲得較高的富集倍數(shù)，實驗在40 mL～140 mL范圍內(nèi)對樣品體積進行了優(yōu)化.結果表明，當樣品體積從40 mL增加至100 mL時，萃取效率略微有所下降，從100 mL增加至140 mL時，萃取效率則明顯下降.綜合考慮，選擇樣品體積為100 mL.

2.2.5 洗脫液的選擇及用量

選擇合適的洗脫液對于提高萃取效率至關重要.分別選用純甲醇，堿性甲醇(含0.01 M氨水的甲醇)，乙腈和丙酮四種溶劑作為洗脫液.結果表明，堿性甲醇的洗脫效果最好，另外研究了它的用量(0.4 mL～1.4 mL)對苯酚萃取效率的影響，實驗證明，1 mL的堿性甲醇能達到最佳的洗脫效果.

2.3 干擾物質的影響

在優(yōu)化的實驗條件下，研究了蜂蜜中共存的物質對苯酚檢測的影響，控制測量誤差在±5 %以內(nèi).結果表明,2 500倍的葡萄糖,1 500倍的脯氨酸,1 000倍的維生素C和咖啡酸，對苯酚的檢測沒有干擾，表明該方法的選擇性較好.

2.4 分析性能研究

在優(yōu)化的實驗條件下，對本方法的分析性能進行評估.結果表明，苯酚在0.05 μg·L-1～125μg·L-1的濃度范圍內(nèi)線性關系良好，線性回歸方程為y= 9.393x+ 3.477，相關系數(shù)(R2)=0.998 6.根據(jù)信噪比(S/N=3)計算得出的檢測限為0.02 μg·L-1.對0.1 μg·L-1的苯酚樣品溶液平行測定7次，得到實驗的相對標準偏差(RSD)為3.1 %.理論富集因子為100.

2.5 實際樣品分析

根據(jù)本文建立的方法，對所購買的蜂蜜樣品進行分析檢測.結果表明，在蜂蜜樣品中未檢測出苯酚.然后，加入不同濃度的苯酚到蜂蜜樣品中進行加標分析，測定結果列于表1.加入0.05 μg·L-1苯酚的蜂蜜樣品的色譜圖如圖2所示.

表1 實驗蜂蜜樣品中苯酚含量的測定結果Tab.1 Analytical results for determination of phenol in the honey sample( mean ± SD，n = 3)

圖2 蜂蜜樣品(a)、蜂蜜樣品加標0.05 μg·L-1苯酚后(b)的高效液相色譜圖
Fig.2 Chromatography of honey sample (a) and the honey sample spiked with 0.05 μg·L-1of phenol(b)

3 結論

將合成的磁性氧化石墨烯復合材料用作磁固相萃取吸附劑，富集蜂蜜樣品中的苯酚，并結合高效液相色譜進行測定.結果表明，所建立的方法可以得到良好的分析結果，包括較寬的線性范圍、較低的檢測限和較高的回收率，適用于蜂蜜樣品中苯酚殘留量的分析檢測.