lncRNA RGMB-AS1在腦膠質瘤預后評估中的價值

程飛飛 劉 江 周紅軍

膠質瘤是最常見的原發性腦腫瘤。據報道，WHO 分級Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤病人5 年存活率在30%～70%，Ⅳ級病人的存活期僅9～12 個月[1]。雖然過去幾十年里，膠質瘤的治療取得了巨大的進步，但是病人總體生存率仍未明顯提高[1]。研究證實，長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）在人類多種腫瘤中異常表達，并參與腫瘤的侵襲和轉移[2]。RGMB-AS1 是近年來發現的 lncRNA。Li 等[3]首次發現lncRNA RGMB-AS1 在非小細胞肺癌中表達上調，能夠促進癌細胞的增殖和遷移。而且，lncRNA RGMB-AS1在肝細胞癌、甲狀腺癌和食管鱗癌等中發揮致癌作用[4～6]。Pan等[7]發現，膠質瘤組織lncRNA RGMB-AS1 表達上調，沉默 RGMB-AS1 表達可以抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，可通過靶向調控miR-1200/HOXB2 信號通路發生致癌作用。本文探討lncRNA RGMB-AS1 在腦膠質瘤病人預后評估中的作用。

1 資料與方法

1.1 標本來源 選取 2014 年 9 月～2017 年 6 月收治的經術后病理檢查證實的腦膠質瘤140 例，術前未接受過放、化療。術中切除膠質瘤組織后，立即凍存于液氮，隨后保存于-80 ℃冰箱。140例中，男72例，女68例；年齡23～78歲，平均（53.68±4.20）歲；術前KPS評分＜80 分 77 例，≥80 分 63 例；WHO 分級Ⅰ級 19例，Ⅱ級45 例，Ⅲ級22 例，Ⅳ級54 例。另選取顱腦損傷內減壓術中切取正常腦組織25 例為對照。本研究已經過本院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量PCR 法檢lncRNA RGMB-AS1 的表達 嚴格按照試劑盒說明書操作。用TRIzol 試劑（美國invitrogen 公司）提取總RNA，隨后利用AMV反轉錄試劑盒（美國Sigma 公司）反轉錄為cDNA。使用2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒（美國Sigma 公司）檢測lncRNA RGMB-AS1 相對表達量。本研究引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司設計并 提 供 。 RGMB- AS1： 上 游 5′- AGTGGGCAAACTTCAACGTTC-3′；下游 5′-GAGCTGCCATTGAATTAATCCG-3′。內參 GAPDH：上游 5′-GAGTCCACTGGCGTCTTC- 3′ ；下 游 5′- GATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′。PCR 反應條件為：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃、20 s，共40個循環。用2-ΔΔCq法計算 RGMB-AS1 相對表達量。以 RGMB-AS1表達量的中位數為截斷值，分為高表達組和低表達組。

1.3 隨訪 140例腦膠質瘤術后以電話和門診方式進行隨訪，每 3 個月隨訪 1 次，隨訪時進行 CT、MRI 或PET 檢查。總體生存期（overall survival，OS）定義為術后第一天至死亡或最后一次隨訪。無進展生存期（progression-free-survival，PFS）指術后至第一次發生疾病進展或任何原因死亡的時間[8]。隨訪時間截止至2019年9月。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行分析；正態分布計量資料用表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用logrank檢驗；多因素Cox比例回歸風險模型檢驗生存期影響因素；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤組織lncRNA RGMB-AS1 的表達變化 140 例膠質瘤中，lncRNA RGMB-AS1 高表達 70 例，低表達70例。膠質瘤組織lncRNA RGMB-AS1的相對表達量明顯高于對照組（P＜0.001）。高級別膠質瘤（WHO 分級Ⅲ～Ⅳ級）lncRNA RGMB-AS1 的相對表達量明顯高于低級別膠質瘤（WHO分級Ⅰ～Ⅱ級；P＜0.001）。見圖1。

2.2 膠質瘤病人生存期的影響因素 多因素Cox比例回歸風險模型分析結果顯示，年齡≥50歲、術前KPS評分＜80分、WHO分級Ⅲ～Ⅳ級、lncRNA RGMB-AS1高表達是腦膠質瘤病人PFS 和OS 的獨立影響因素（P＜0.05），見表1、2。

2.3 140 例腦膠質瘤病人的生存曲線分析結果 140例膠質瘤的PFS 在1～60 個月，中位數為17 個月（四分位間距：14～42 個月）；OS 在3～60 個月，中位數為21個月（四分位間距：15～50個月）。lncRNA RGMBAS1 低表達組 PFS 在 5～60 個月，中位數為 52 個月（四分位間距：34～56 個月）；OS 在6～60 個月，中位數為52 個月（四分位間距：38～55 個月）。lncRNA RGMB-AS1高表達組PFS在1～42個月，中位數為11個月（四分位間距：6～27 個月）；OS 在3～44 個月，中位數為18 個月（四分位間距：14～35 個月）。lncRNA RGMB-AS1 低表達組PFS 和OS 均較高表達組明顯延長（P＜0.001，見圖2）。

2.4 不同級別膠質瘤病人的生存曲線分析結果

2.4.1 低級別膠質瘤 lncRNA RGMB-AS1 高表達組PFS 在 7～58 個月，中位數為23 個月（四分位間距：16～38 個月）；OS 在8～60 個月，中位數為25 個月（四分位間距：20～41 個月）；lncRNA RGMB-AS1 低表達組PFS在5～60個月，中位數為53個月（四分位間距：43～56 個月）；OS 在7～60 個月，中位數為51 個月（四分位間距：43～55 個月）。lncRNA RGMB-AS1 低表達組PFS 和OS 均較高表達組明顯延長（P＜0.05，圖3）。

表1 腦膠質瘤病人無進展生存期影響因素的Cox比例回歸風險模型分析結果

表2 腦膠質瘤病人總體生存期影響因素的Cox比例回歸風險模型分析結果

2.4.2 高級別膠質瘤 lncRNA RGMB-AS1 高表達組PFS 在5～27 個月，中位數為9 個月（四分位間距：5～13個月）；OS在5～36個月，中位數為13個月（四分位間距：8～25個月）。低表達組PFS在5～43個月，中位數為18 個月（四分位間距：12～27 個月）；OS 在6～44個月，中位數為19 個月（四分位間距：14～30 個月）。lncRNA RGMB-AS1低表達組PFS 和OS 均較高表達組明顯延長（P＜0.05，圖3）。

圖2 lncRNA RGMB-AS1低表達組與高表達組腦膠質瘤病人的生存曲線

3 討論

圖3 不同級別膠質瘤病人生存曲線

lncRNA在膠質瘤的發生和發展中起重要作用，對膠質瘤的早期診斷及預后評估有一定意義[9]。lncRNA RGMB-AS1位于人類染色體5q21.1，長度為2 053 bp。lncRNA RGMB-AS1在多種腫瘤中表達上調。Li 等[10]發現 lncRNA RGMB-AS1 與排斥導向分子b的表達呈負相關，lncRNA RGMB-AS1可能通過調控排斥導向分子b外顯子2介導其表達，進而參與肺腺癌的發生與發展。Zhang等[5]發現，E2F1可以通過激活lncRNA RGMB-AS1 促進甲狀腺腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。Xu 等[4]也發現，lncRNA RGMBAS1 可以通過靶向調控miR-22/NLRP3 信號通路促進食管鱗癌細胞的侵襲。本文結果顯示，與正常腦組織比較，膠質瘤組織lncRNA RGMB-AS1 表達水平明顯升高；高級別膠質瘤組織lncRNA RGMB-AS1表達水平明顯高于低級別膠質瘤；此外，lncRNA RGMB-AS1 高表達膠質瘤病人預后更差。這提示lncRNA RGMB-AS1可能與膠質瘤發生和發展有關。本文結果發現lncRNA RGMB-AS1 表達水平與膠質瘤WHO 分級呈正相關，說明lncRNA RGMB-AS1 與膠質瘤的惡性程度相關。膠質瘤病人預后的影響因素有很多，包括年齡、基因多態性、免疫、KPS 評分、WHO 分級和手術方式等[11]。本文發現lncRNA RGMB-AS1高表達是膠質瘤病人預后不良的獨立影響因素，lncRNA RGMB-AS1 高表達的膠質瘤病人PFS 和OS 較低表達病人明顯縮短，并且這種差異與膠質瘤病理分級無關。

綜上所述，lncRNA RGMB-AS1表達水平與膠質瘤惡性程度和分化程度有關。lncRNA RGMB-AS1高表達水平與膠質瘤病人的不良預后有關。這提示lncRNA RGMB-AS1可作為膠質瘤的分子標志物。