鈣蛋白酶-1在膠質瘤組織中的表達及其對U87細胞侵襲和遷移的影響

喬卿均 郭 曉 王淇民

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，雖然采用手術聯合放、化療可延長病人生存期，但膠質瘤病人中位生存期仍不足2 年[1，2]。研究表明，膠質瘤細胞向周圍腦實質侵襲、遷移是導致其難以治愈的重要原因[3]。鈣蛋白酶-1 是一種蛋白水解酶，與多種腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移能力有關，對腫瘤發生、發展具有重要作用[4]。本文探討膠質瘤組織鈣蛋白酶-1 表達變化及抑制鈣蛋白酶-1 對U87 細胞侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集 2015 年 1 月至 2018 年 3 月手術切除的膠質瘤組織和瘤旁正常腦組織各57 例，WHO（2016版）分級Ⅱ級18例，Ⅲ級24例，Ⅳ級15例[5]；均為首發，且術前未進行放療、化療等輔助治療。本研究獲得本院倫理委員會批準。

1.2 U87細胞培養、轉染及分組 將U87細胞（北京北納創聯生物技術研究院）置于含有10%胎牛血清的DMEM 中培養并傳代。取對數生長期U87 細胞，接種于6孔板，參照LipofectamineTM2000（美國Invitrogen 公司）說明書，將陰性對照小干擾RNA（negative control-small interfering RNA，NC-siRNA）和鈣蛋白酶-1 siRNA 分別轉染至U87 細胞。將細胞分為3組：對照組（未轉染細胞）、NC組（轉染NC-siRNA）和鈣蛋白酶-1組（轉染鈣蛋白酶-1 siRNA）。

1.3 RT-PCR檢測鈣蛋白酶-1 mRNA表達水平 使用Trizol 試劑（日本TaKaRa 公司）提取膠質瘤組織、瘤旁正常腦組織及U87細胞總RNA，反轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）合成cDNA，使用SYBR Green RTPCR試劑盒（日本TaKaRa 公司）進行RT-PCR，以βactin為內參，2－ΔΔCt計算鈣蛋白酶-1 mRNA相對表達量。RT-PCR 條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s；54 ℃退火60 s；72 ℃延伸 30 s；設置40 個循環；72 ℃延伸5 min。每個樣本重復三次。

1.4 RT-PCR檢測U87細胞轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9 mRNA 表達水平 使用Trizol 試劑（日本TaKaRa 公司）提取U87 細胞總RNA，反轉錄合成 cDNA，RT-PCR 檢測 TGF-β、MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平。

1.5 免疫印跡法檢測膠質瘤組織、瘤旁正常腦組織和U87 細胞鈣蛋白酶-1 蛋白表達水平 使用蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取膠質瘤組織、瘤旁正常腦組織及U87細胞總蛋白，定量后進行SDS-PAGE分離目的蛋白，轉移至PVDF膜封閉2 h，加入鈣蛋白酶-1 抗體一抗（1:200）4 ℃過夜，加入二抗（1:500）室溫孵育1 h，顯色后在GelDoc XR Biorad凝膠成像系統（美國Bio-rad公司）下掃描拍照，以βactin為內參，采用Image J軟件分析每個樣本蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值之比，以其比值作為鈣蛋白酶-1蛋白表達水平。

1.6 Transwell實驗檢測U87細胞侵襲能力 實驗前將基質膠加入Transwell 小室中，37 ℃孵育30 min。將U87 細胞以每孔1×105個懸浮于無血清培養液中。取2 ml 懸浮細胞加入Transwell 小室的上室中，同時在下室中加入1 ml 含血清細胞培養液，培養24 h。用棉簽擦掉膜頂部細胞，經4%聚甲醛固定20 min后，0.1%結晶紫染色，洗滌后，在200 倍顯微鏡下對隨機5個視野區域進行細胞計數，重復3次。

1.7 劃痕實驗檢測U87 細胞遷移能力 取培養24 h的U87細胞，用200 μl移液槍槍頭在6孔板底部劃出一條細痕，用PBS緩沖液將劃下的細胞沖洗掉，繼續培養 24 h，TS100 倒置相差顯微鏡（日本NIKON 公司）下放大100倍觀察細胞遷移情況，并測量劃痕寬度。細胞遷移率=（0 h 劃痕寬度-48 h 劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。重復3次。

1.8 統計學分析 應用SPSS 22.0軟件分析，計量資料用表示，采用方差分析和t檢驗；以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤組織鈣蛋白酶-1 mRNA和蛋白表達水平變化 膠質瘤組織鈣蛋白酶-1 mRNA 和蛋白表達水平均明顯高于瘤旁正常腦組織（P＜0.05）。見圖1。

2.2 U87 細胞鈣蛋白酶-1 mRNA 和蛋白表達水平 鈣蛋白酶-1 組U87 細胞鈣蛋白酶-1 mRNA 和蛋白表達水平均明顯低于對照組和NC組（P＜0.05），而對照組和NC組均無統計學差異（P＞0.05）。見圖2。

2.3 細胞侵襲和遷移情況 鈣蛋白酶-1 組U87 細胞侵襲數目明顯低于對照組和NC組（P＜0.05），細胞遷移率明顯低于對照組和NC 組（P＜0.05）；對照組和NC 組U87 細胞侵襲數目和細胞遷移率均無統計學差異（P＞0.05）。見圖3。

2.4 U87 細胞 TGF-β、MMP-2 和MMP-9 mRNA 表達水平 鈣蛋白酶-1 組 TGF-β、MMP-2 和 MMP-9 mRNA 表達水平均明顯低于對照組和NC 組（P＜0.05），而對照組和NC 組均無統計學差異（P＞0.05）。見圖4。

3 討論

圖1 膠質瘤組織和瘤旁正常腦組織中鈣蛋白酶-1 mRNA和蛋白表達水平

圖2 各組U87細胞鈣蛋白酶-1 mRNA和蛋白表達水平

圖3 各組U87細胞侵襲和遷移情況

圖4 各組U87細胞TGF-β、MMP-2和MMP-9水平比較

鈣蛋白酶-1是重要的胞質蛋白水解酶，與乳腺癌、卵巢癌、胃癌等轉移和侵襲行為有關[6]。本文結果顯示，膠質瘤組織鈣蛋白酶-1 mRNA 和蛋白表達水平均顯著高于瘤旁正常腦組織，說明鈣蛋白酶-1在膠質瘤中呈高表達。研究報道，鈣蛋白酶-1在口腔鱗狀細胞癌中高表達，與癌細胞侵襲和遷移有關，其作用是擾亂細胞周期、抑制MMP和上皮間質轉化實現的[7]。腫瘤轉移是癌癥難治及死亡原因之一，而癌細胞侵襲和遷移是腫瘤轉移的重要標志[8]。本文結果表明，沉默人膠質瘤U87 細胞鈣蛋白酶-1 表達后，細胞侵襲和遷移能力明顯下降，說明沉默鈣蛋白酶-1 表達可有效抑制膠質瘤細胞侵襲和遷移。癌細胞上皮間質轉化過程是腫瘤惡化表現之一，不僅與腫瘤轉移有關，與腫瘤治療抵抗和復發也密切相關[9]。上皮間質轉化過程導致的一系列生理病理改變過程主要依賴于MMP 等降解細胞外基質的蛋白酶[10]。TGF-β是MMP和下游Smad信號的調節因子，可增強MMP誘導的退行性變化，是誘導上皮間質轉化的重要因子[11]。譚維軍等[12]研究表明，TGF-β誘導肺疾病肺泡上皮間質轉化通過上調鈣蛋白酶實現，而鈣蛋白酶抑制劑可抑制上皮間質轉化發生。本文結果發現，沉默U87 細胞鈣蛋白酶-1 表達，細胞MMP-2、MMP-9、TGF-β表達水平顯著降低，說明沉默鈣蛋白酶-1 表達，可能通過抑制上皮間質轉化，抑制癌細胞侵襲和遷移。

總之，人腦膠質瘤鈣蛋白酶-1 呈高表達，與腫瘤細胞侵襲和遷移有關，抑制鈣蛋白酶-1 表達，可能通過抑制TGF-β、MMP-2、MMP-9表達，影響上皮間質轉化而抑制膠質瘤細胞侵襲和遷移。這提示鈣蛋白酶-1可能是膠質瘤發生、發展中重要的生物標志物，對膠質瘤臨床治療及預后評估具有指導意義。