非小細胞肺癌組織中性別決定區Y框蛋白2、糖原合成酶激酶-3β表達觀察

楊岳峰，王茜，劉利玲，李帥，李娟

1成都醫學院，成都 610500；2成都醫學院第一附屬醫院

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康，每年新增患者超過200萬人[1]，其中女性患者增幅更加明顯。根據組織類型的不同，將肺癌分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，后者約占80%[2]。近年來，盡管腫瘤的治療不斷取得進展，新的靶向藥物相繼上市，但NSCLC患者五年生存率仍低于20%[3]。性別決定區Y框蛋白2(SOX2)位于3q26.3-q27上，是性別決定區家族基因成員之一，其異常表達與腫瘤干細胞發生有密切聯系，對腫瘤惡性生物學過程有促進作用[4,5]。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶，能促進線粒體介導死亡內源性細胞凋亡和抑制死亡受體介導的外源性細胞凋亡[6,7]，與卵巢癌、膠質瘤等的增殖、分化有關[8,9]。研究認為，GSK-3β是NSCLC的主要負調控因子，表達缺失會促進腫瘤干細胞自我更新誘發腫瘤形成。但SOX2、GSK-3β在NSCLC中作用的相關性尚不明確。本研究觀察了NSCLC癌組織中SOX2、GSK-3β的表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1～12月西部戰區總醫院收治的NSCLC患者42例，男26例，女16例；年齡43～77歲，其中60歲19例、>60歲23例；低分化14例，中分化16例，高分化12例；組織學類型為腺癌25例，鱗癌17例；根據國際抗癌聯盟(UICC)肺癌TNM分期系統第七版進行分期，Ⅰ期19例，Ⅱ期13例，Ⅲ期10例；腫瘤直徑>3 cm者有15例，3 cm者27例；發生淋巴結轉移15例，未發生淋巴結轉移27例；有吸煙史22例，無吸煙史20例；侵犯被膜26例，未侵犯被膜16例。納入標準：①所有組織標本均經病理科高級職稱醫師復閱切片，確診為NSCLC(2015年WHO肺腫瘤組織學分類標準)；②入組患者術前均未行放、化療或其他治療；③一般情況可，無嚴重肝腎疾病。手術留取NSCLC組織及其對應癌旁組織(距腫瘤組織2.0 cm以上)各42例份(分別記為腫瘤組和癌旁組)，標本的獲取提前與患者及其家屬溝通獲得其知情同意。

1.2 組織中SOX2、GSK-3β檢測方法 采用免疫組化SP法。標本常規石蠟包埋，切片，切片厚3～4 mm，常規用二甲苯脫蠟、乙醇復水，用內源性過氧化物酶阻斷劑(3%的過氧化氫)阻斷內源性過氧化物酶活性，在微波爐中用檸檬酸鹽緩沖劑進行抗原修復，抗原的位點充分暴露，用山羊血清恒溫孵育封閉內源性非特異性抗原，加一抗SOX2(濃度1∶200，一般為50 μL/每片)，于4 ℃冰箱中過夜，加二抗試劑3(山羊抗兔型)、二抗試劑4(辣根霉標記鏈霉卵白素工作液)，DAB顯色，染色及鹽酸酒精分色，脫水透明，封片，癌旁正常組織作陰性對照。SOX2蛋白定位于細胞核，細胞核中出現棕色顆粒為陽性表達；GSK-3β蛋白位于細胞質中，細胞質中出現黃色顆粒為陽性表達。采用半定量計分法判斷SOX2、GSK-3β的表達強度：以切片中陽性細胞染色深淺評分，無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；以切片中陽性細胞比例評分，隨機計數5個高倍視野，陽性細胞數<5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；兩計分相乘取平均值，均值<1為陰性，其余為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，兩定性資料的關聯性分析使用Pearson列聯系數，等級資料的相關性分析采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組SOX2、GSK-3β陽性率比較 腫瘤組和癌旁組SOX2陽性率分別為73.8%、4.8%，GSK-3β陽性率分別為47.6%、100%，兩組比較，P均<0.05(見圖1、圖2)。

圖1 SOX2在鱗癌中的表達(×400)

圖2 GSK-3β在腺癌中的表達(×200)

2.2 SOX2、GSK-3β表達與NSCLC臨床病理特征的關系 結果見表1，由表1可知，SOX2表達與NSCLC分化程度呈負相關，GSK-3β表達與NSCLC是否發生淋巴結轉移呈正相關(P均<0.05)。

表1 SOX2、GSK3-β表達與NSCLC臨床病理特征的關系

2.3 NSCLC組織中SOX2、GSK-3β表達的相關性 NSCLC組織中SOX2與GSK-3β表達無相關性(P>0.05)。

3 討論

肺癌是世界范圍內惡性腫瘤死亡的首要原因，由于早期癥狀不典型，多數患者就診時已處于晚期，導致其預后差。近年來，肺癌的早期診斷標志物、治療靶點以及預后標志物成為研究的熱點。腫瘤干細胞在腫瘤的發展中具有重要作用。研究發現，SOX2和 GSK-3β的表達與腫瘤干細胞的發生、發展密切相關。但目前關于SOX2和 GSK-3β在NSCLC中的表達情況少有報道，本實驗希望探討兩者在NSCLC的表達及其臨床意義。

干細胞轉錄因子SOX2是SOX家族成員之一，在胚胎干細胞發育過程中對維持胚胎干細胞特性和重編程起關鍵作用，與靶基因G結構域特異性結合調控細胞分化[10,11]。SOX2異常表達與腫瘤干細胞發生有密切聯系，對腫瘤惡性生物學過程有促進作用。已證實在胰腺癌、結直腸癌、宮頸癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤中表達升高[12～15]。研究[16]發現，腫瘤的形成、轉移、入侵過程會消耗干擾素跨膜蛋白1(IFITM1)，體內IFITM1缺少會使腫瘤受抑制，SOX2表達會一定程度彌補IFITM1缺乏，從而繼續促進腫瘤的發生和發展。人類GSK-3β基因包含12個外顯子，定位于1號外顯子,基因產物為46 kD蛋白質，包含433種氨基酸。GSK-3β在細胞增殖、細胞周期的連續性，胚胎發育[17]及胰島素反應[18]等生理過程中都具有重要作用，并與阿爾茲海默癥及抑郁癥發生有關。腫瘤方面，GSK-3β被認為是腫瘤潛在的調控因子，尤其是在Wnt/β-catenin信號通路中的調節作用被廣泛認同，β-catenin進入胞核與含高遷移率組(HMG)特征性結構域的因子形成復合物促進Wnt信號靶基因轉錄，被異常激活的Wnt信號靶基因與細胞增殖活化異常及腫瘤形成有密切關系，胞核中β-catenin被GSK-3β磷酸化后可抑制這一過程[7,8]。SOX2與GSK-3β對腫瘤某些方面有相似的生物學效應。GSK-3β在Wnt/β-catenin信號通路中發揮作用被認為是其調控腫瘤的主要途徑。SOX2通過ChIP結合在β-catenin的啟動子區域上，對β-catenin發揮轉錄調控作用。

本研究顯示，SOX2在NSCLC癌組織中陽性率為73.8%，在癌旁組織中陽性率為4.8%，SOX2在NSCLC癌組織中呈高表達,提示SOX2的異常調節可能在腫瘤的發生、發展中起重要作用。SOX2表達與NSCLC腫瘤分化程度有關，SOX2表達越高，腫瘤分化程度越低。而與患者性別、年齡、組織學類型、TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移、被膜侵犯均無關。因此，SOX2可能是NSCLC的始動因素之一并能影響腫瘤的分化。NSCLC組織中GSK-3β陽性率為47.6%，較癌旁組織的表達顯著下調，推測其表達異?？赡苡绊懩[瘤的發生。GSK-3β表達與NSCLC淋巴結轉移有關，提示其可能影響腫瘤的侵襲轉移能力。利用兩者在調控Wnt/β-catenin信號通路方面有平行關系可以解釋當腫瘤正性調控因素(SOX2陽性、GSK-3β陰性)同時出現時腫瘤發生率明顯高于同時不出現(38.1%和14.3%)，同時表達時生物學效應更強。本研究顯示，NSCLC組織中SOX2和GSK-3β表達無相關性，可能與樣本量偏少有關，尚需更大規模的進一步實驗研究予以闡明。

總之，NSCLC組織中SOX2表達升高，GSK-3β表達降低，SOX2和GSK-3β的表達與NSCLC的發生發展可能有關，聯合檢測有望為NSCLC早期診斷及分析、靶向治療和預測預后提供參考。