石油烴混合降解菌對汽油污染土的降解條件優化試驗研究

曹小方 方祥位 劉漢龍 張楠 張娟

摘 要： 為測定實驗室提取的5種石油烴降解菌的混合菌懸液對汽油污染土的降解效果，利用氣相色譜 質譜聯用儀對經過降解菌降解的汽油污染土化合物進行定性分析，以鑒定此混合菌懸液對汽油污染土是否有降解能力;考慮pH值、溫度、土壤含水率及降解菌接種量等因素，采用單因素試驗和多因素正交試驗進行降解率測定，以優化此混合菌懸液對汽油污染土的降解條件。試驗結果表明，單因素試驗條件下，經過試驗前后化合物組分比較發現，實驗室提取的5種混合降解菌對汽油污染土有良好的降解能力;由相對峰面積比圖發現，溫度和降解菌接種量相對于含水率和pH值這兩個因素來說，對混合降解菌降解效果的影響更為顯著;當pH值在6～8、降解溫度在30～35 ℃、含水率在15%～25%、降解菌接種量在1～2.5 mL范圍時，混合菌懸液的降解效果相對明顯。多因素正交試驗條件下，混合菌懸液的最佳降解條件是：溫度為32 ℃，pH值為7，降解菌接種量為1 mL，含水率為25%。

關鍵詞： 汽油污染土;降解菌;混合菌懸液;生物降解;正交試驗

中圖分類號：X53;X172? ? 文獻標志碼：A? ?文章編號：2096-6717（2020）02-0195-08

Optimization of degradation conditions of gasoline-contaminated soil by petroleum hydrocarbon-degrading bacteria

Cao Xiaofang1a， Fang Xiangwei1a，1b， Liu Hanlong1a，1b， Zhang nan2， Zhang Juan1c

（1a.School of Civil Engineering; 1b.Key Laboratory of New Technology for Construction of Cities in Mountain Area， Ministry of Education; 1c.Industrial Technology Research Institute， Chongqing University， Chongqing 400045， P.R.China;2.School of General Education， Chongqing Technology and Business University， Chongqing 400020， P.R.China）

Abstract： In order to determine the degradation of mixed bacterial suspension of five petroleum hydrocarbon degrading bacteria extracted in the laboratory on gasoline-contaminated soil， we had made use of gas chromatography-mass spectrometry to implement qualitative analysis on gasoline-contaminated soil compounds degraded by degrading bacteria in order to assess whether such mixed bacterial suspension has the ability to degrade the gasoline-contaminated soil.Moreover， considering the factors of pH value， temperature， soil moisture content and inoculation amount of degrading bacteria， single factor test and multi-factor orthogonal test were adopted to determine the degradation rate with the purpose of optimizing the degradation conditions of gasoline-contaminated soil by the mixed bacterial suspension.Under the single factor test， the compound components before and after the test were compared， it was found that these five degrading bacteria extracted in the laboratory have good ability to degrade the gasoline-contaminated soil.And from the relative peak area ratio chart， it is discovered that temperature and inoculation of degrading bacteria have more significant effects on the degradation of degrading bacteria than moisture content and pH.When the pH is between 6 and 8， the degradation temperature between 30 ℃ and 35 ℃， the moisture content between 15% and 25% and the inoculation amount of degrading bacteria between 1 ml and 2.5 ml， the degradation effect of mixed bacterial suspension is relatively obvious.Under the condition of multi-factor orthogonal test， the optimum degradation conditions of mixed bacterial suspension are as follows： temperature is 32℃; pH value is 7; inoculation amount of degrading bacteria is 1 mL and water content is 25%.

Keywords： gasoline contaminated soil; degrading bacteria; mixed bacterial suspension; biodegradable; orthogonal test

石油作為重要的能源之一，在開采、運輸、加工和產品的使用過程中由于操作不慎或偶然事故容易造成相當量的石油進入自然界，這已經成為世界性環境問題，土壤汽油污染是石油在生產過程中造成的污染之一[1]。

近年來，隨著人們環保意識的不斷增強，加強土壤生態環境的保護，進行石油污染土壤修復的研究已經成為決策層和科研工作者的共識[2]。通常用于石油污染土壤的修復技術包括物理修復法（如焚燒法、隔離法、換土法、超聲清洗法等），化學修復法（如化學淋洗技術、化學鈍化技術等），利用豆科、禾本科或觀賞植物修復法，微生物修復法，植物和微生物聯合修復法等[3-7]。微生物修復法即利用微生物的代謝活動來降解污染物，減少或最終消除污染的過程[8-9]。與物理、化學方法相比，生物修復對人和環境造成的影響小，且修復費用僅為傳統物理、化學修復的30%～50%，是一種高效、經濟和環境友好的修復技術[10]。已有研究表明，利用土著微生物降解土壤中的汽油效率低且時間長，在處理汽油污染土的過程中，僅靠土壤中的土著微生物無論是修復效果還是修復時間都不夠理想，往往需要人為投入高效降解菌劑或者人為投放改性表面活性劑。微生物修復法是目前最有前途的方法之一，通過這種有效和環保的方式來減少污染，既能降低石油烴在生產、運輸、消費過程中對公眾健康和自然資源產生的危害，且成本低，又能減少二次污染[11]。

卞立紅等[12]利用石油污染土中提取的D和H兩種菌，研究了兩種菌的混合菌對油田采出水中聚丙烯酰胺和石油烴的降低效果，試驗結果表明，當復合菌接種量體積分數為5%時，合成培養基的降解效果最好。楊洋等[13]通過對西南印度洋中脊與印度洋中部深海沉積物中石油降解菌的富集培養和分離鑒定，發現有很多細菌對石油烴都有降解效果。宜慧等[14]通過單因素試驗和多因素正交試驗得出各因素對TPH降解率影響程度的大小次序和最適處理條件下菌株SC-6的TPH降解率，并且通過原油污染土壤生物修復試驗得出，高效石油烴降解菌的投加有利于土壤TPH降解率和酶活性的提高。彭懷麗等[15]以正十六烷作為唯一碳源從石油污染土中篩選出一株能夠很好地降解正十六烷的菌株TZSX2，菌株的最適生長和降解溫度在28～36 ℃之間，在低溫15 ℃以下和高溫45 ℃時對正十六烷的降解率仍在10%以上。

以上研究表明，土著微生物對石油烴污染有降解能力，經過人為提純、改性和誘變等手段使土著微生物成為專性降解菌更有利于污染物的降解。但僅靠微生物自身的降解能力有時很難滿足修復中所要達到的降解效果，往往需要人為投加生物表面活性劑（BS）。將表面活性劑（SAA）技術應用于修復石油污染土壤的微生物治理技術是近些年興起的一種工程技術。表面活性劑強化土壤洗滌是一種快速有效的PAHs污染土壤修復方法[16-18]。Pourfadakeri等[19]、孫霞等[20]、榮璐閣[21]、吳雪茜[22]均通過降解試驗證實，通過人為加入表面活性劑，降解菌的降解效果得到了較大提升。

無論以石油污染土、潤滑油污染土、礦物油污染土還是柴油污染土為試驗對象，已有的試驗結果表明，通過人為投入高效降解菌劑和人為投放改性表面活性劑這兩種方式均有利于污染土的降解。在石油烴污染土微生物技術修復方面已有較多研究成果，但關于汽油污染土混合降解菌的降解試驗卻鮮有報道。筆者以人為拌制的汽油污染土為研究對象，通過向其中加入實驗室自行提取的5種石油烴降解菌的混合菌懸液，研究pH值、溫度、土壤含水率及降解菌接種量等對混合降解菌降解汽油污染土能力的影響，得到降解的優化環境條件，為汽油污染土的微生物修復技術提供科學依據。

1 試驗概況

1.1 菌種的提取與鑒定

用于菌種提取的石油污染土取自甘肅省成縣油氣管道轉換站地表層以下2～15 cm處。菌種提取所用培養基配方如下：

1）LB培養基：胰蛋白胨1.00 g，酵母粉0.50 g，NaCl 1.00 g，蒸餾水定容至100 mL，用2 mol/L NaOH和1 mol/L HCL調節pH值為7，高溫蒸汽滅菌20 min（固態培養基需加瓊脂粉2.00 g）。

2）無機鹽培養基：NaCl 0.1 g，NH4Cl 0.05 g，KCl 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCl2和FeCl3·6H2O痕量，蒸餾水定容到100 mL，高溫蒸汽滅菌30 min。

3）降油培養基：NaCl 10 g，NH4Cl 0.50 g，KH2PO4 0.50 g，K2HPO41.0 g，MgSO4 0.50 g，CaCl2 0.1 g，KCl 0.10 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水定容至1000 mL，95號汽油4 g，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

石油污染土中菌種提取的步驟為：稱取石油污染土1.0 g放入裝有9.0 mL無菌生理鹽水的試管內，利用梯度稀釋法對其進行稀釋，從10-3、10-4和10-5這3個梯度中用移液器吸取20 μL的稀釋液，經接種、滅菌、涂布、培養等步驟后，觀察并記錄菌落形態，挑取不同形態的單菌落接種到固體培養基中，重復多次，對菌種進行純化后，分別進行生理、生化實驗，然后將純化后的菌株接種于相應的培養基斜面，在培養箱內培養24 h后，保存于4 ℃的冰箱內。

從石油污染土中共分離出9株菌株，對每株菌株的DNA進行提取，利用細菌的通用引物進行PCR擴增，得到約1 500 bp條帶后，通過Sanger法進行測序（擎科興業生物有限公司完成），將得到的序列利用BLAST軟件與GenBank數據庫中的序列進行同源性比對，從而確定菌株的類別。具體的鑒定結果為：菌1為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），菌2為假單胞菌屬（Pseudomonas），菌3為蒼白桿菌屬（Phytophthora），菌4為博得特氏菌屬（Bordetella），菌5為戈登氏菌屬（Gordonia），菌6為同溫層芽孢桿菌（Bacillus），菌7為洛菲不動桿菌（Acinetobacter），菌8為瓊氏不動桿菌（Acinetobacter junii），菌9為暹羅芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），以上提取的9種降解菌均為石油污染土中原有的細菌，均不是致病菌，對環境無危害。

根據單一降解菌在降油培養基內降解汽油污染土6 d的試驗結果，菌1、2、3、4和5的汽油降解率均超過69%。證明菌1、2、3、4和5降解汽油的能力較好，選取前5種降解菌配制試驗所需混合菌懸液。

1.2 試驗材料

試驗土樣取自重慶大學B區操場地下車庫基坑，將取得的土樣去除碎石、樹枝、樹葉等雜質，自然風干、碾碎，依次通過30目標準篩，將處理后的土壤人工加入95#汽油，配制成5%的汽油污染土，在陰涼通風處放置一周，期間定時、定量噴灑蒸餾水，以保證污染土20%的特定含水率，且每天定時翻土。將處理后的土壤放入烘干箱內，105 ℃烘干3 d，待土壤溫度降到室溫，將土壤樣品封裝，放入干燥器保存待用。

試驗采用10%混合菌懸液，采用濕重法配制，具體方法為：取出保存的純菌種復活于LB平板，挑取單菌落培養于LB液體培養基，在32 ℃、200 r/min的搖床內振蕩培養24 h（菌5振蕩培養48 h），4 000 r/min離心15 min，去上清液，稱菌體濕重，用質量濃度為0.85%的無菌生理鹽水配制質量分數為10%的菌懸液。5種降解菌的菌懸液組成混合菌懸液，每種菌均占混合菌懸液體積的1/5。

1.3 試驗方案

單因素試驗：以自制5%的汽油污染土為對象，以pH值為7、溫度為32 ℃、含水率為20%、降解菌接種量為1 mL為基礎，分別改變pH值、溫度、土壤含水率及降解菌接種量4個因素，在恒濕恒溫培養箱中降解11 d后，進行汽油污染土降解率的測定與分析，為排除汽油的揮發性對試驗結果的影響，試驗中設置空白對照組。

多因素正交試驗：以自制5%的汽油污染土為對象，選擇pH值、溫度、土壤含水率及降解菌接種量4個因素，根據單因素試驗結果各取3個較優水平，設計四因素三水平正交試驗，在恒濕恒溫培養箱中降解11 d后，進行汽油污染土降解率的測定與分析，為排除汽油的揮發性對試驗結果的影響，試驗中設置空白對照組。

1.4 測試方法

定性試驗測試方法：采用氣相色譜 質譜聯用儀（GC-MS）進行測試，GC-MS是由氣相色譜（GC）和質譜檢測器（MS）兩部分結合起來所組成的。GC-MS主要用于分析極性小、易揮發、分子量較?。ㄙ|荷比1 000以內）的有機化合物。用于試驗的污染土樣為汽油污染土，汽油的主要成分為C5～C12的脂肪烴和環烷烴類，以及一定量的芳香烴，均為小分子量的有機物，滿足氣相色譜 質譜聯用儀的測試條件。

定量試驗測試方法：采用紫外分光光度法測定汽油污染土降解率。土壤中汽油含量測定：取降解后污染土于離心管中，加入石油醚，進行超聲萃取，100 W萃取30 min，萃取后進行離心，4 000 r/min離心10 min，用1 mol/L鹽酸進行酸化，提取上清液保存、待測。

2 結果與分析

2.1 定性試驗結果

峰面積比是指在色譜圖中，背景線以上部分的總面積，一般表示待測物的含量，面積越大，含量越高。選取單因素試驗條件下相對分子質量分別為56.1、57.1、71.7和191.1的4種化合物為分析對象，由GC-MS所得數據，提取相對分子質量為56.1、57.1、71.7和191.1的4種化合物的峰積分面積比并計算其相對峰積分面積比。不同條件、同一時間下，4種化合物的相對峰積分面積比如圖1所示。圖中試驗編號19為汽油污染土的空白樣（CK），試驗編號1～6為以pH值為唯一變量試驗組的柱狀圖，試驗編號7～11為以含水率為唯一變量試驗組的柱狀圖，試驗編號12～13為以溫度為唯一變量試驗組的柱狀圖，試驗編號14～18為以降解菌接種量為唯一變量試驗組的柱狀圖。

由圖1可以發現，試驗組4種不同化合物的含量與空白組（CK）相對應4種不同化合物的含量之間有顯著差異。編號13的試驗組相對于編號19的空白組，4種不同化合物的含量均有大幅度增長。不同化合物含量的顯著變化側面反映了降解菌在編號為13所對應的降解條件下，可以通過降解汽油污染土中某種化合物合成這4種不同化合物。編號13、14、15、16和17的5個試驗組的柱狀圖與空白組的柱狀圖相比，4種不同化合物含量變化比其他試驗組更加顯著，說明溫度與降解菌接種量相對于含水率和pH值這兩個因素對汽油污染土的降解效果影響更為顯著。

2.2 定量試驗結果

2.2.1 單因素優化試驗

1）pH值

pH值大小對微生物代謝過程影響顯著。石油烴降解菌與大多數微生物一樣，一般情況下，適宜生長的pH值范圍為6～8。極端pH值環境不利于微生物的生長，易影響生物修復效果，pH值過低會影響N的轉化，略高于中性時，對硝化作用有利。pH值對汽油污染土降解效果的影響如圖2所示。

由圖2可知，混合菌懸液在pH值為7時，汽油污染土的降解率最高，為44.78%。當pH值低于或高于7時，混合菌懸液對汽油污染土的降解率均呈下降趨勢，強酸情況下，降解率下降更為明顯。由此可見，此混合菌懸液更適合在中性或者弱堿性環境中生存，強堿和強酸均會影響其降解能力。這是由于pH值除了與微生物的生命活動有關外，還能對環境中有機物（如營養物質和有機污染物）的離子化程度產生影響，進而間接影響微生物對汽油污染土的降解。酸性條件下，H+會影響微生物膜的結構，pH值越低，微生物的膜結構越不穩定。堿性條件下，過多的OH-會引起細胞膜上的電荷變化，阻礙細胞膜對營養物質的運輸過程。此外，由于微生物對污染物的降解依賴于其產生的活性物質（酶），過多的H+和OH-均會對酶活性產生影響，阻礙其正常代謝。因此，所研究混合菌懸液的最適pH值范圍為7～8，適宜在中性以及弱堿的土壤環境中生長。

2）溫度

溫度不僅影響石油烴的物理狀態，還對微生物的活性以及汽油污染土的揮發性有著直接的影響。適宜的溫度是混合菌懸液降解土壤汽油的重要條件。溫度主要通過影響汽油的物性和微生物自身活性來影響降解過程[23]。由單因素試驗得知，溫度是影響所用混合降解菌降解效果的重要因素。溫度對汽油污染土降解率的影響如圖3所示。

由圖3可以看出，溫度對汽油污染土降解率的影響較大。在所研究溫度范圍（20～40 ℃）內，隨著溫度的不斷升高，混合菌懸液對汽油污染土的降解率整體呈先增大后減小的規律，但在溫度范圍為25～32 ℃內，降解率增加速率較緩慢，原因可能是在降解溫度接近30 ℃時，雖然混合降解菌的降解速率很高，但由于在此溫度范圍內汽油的揮發量也很大，因此，此溫度范圍內，汽油的降解率增長緩慢。在32 ℃左右，混合菌懸液對汽油污染土的降解率達到最大，為42.24%。當溫度低于25 ℃時，混合菌懸液對汽油污染土的降解率普遍不高。這是因為較低溫度往往容易導致微生物酶活性的降低，進而抑制了微生物的生長。此外，低溫使汽油黏度增大，難以揮發和被微生物充分利用。當溫度高于32 ℃時，混合菌懸液對汽油污染土的降解率快速降低。這是因為較高溫度條件下，由于汽油的大量揮發，使得污染土中容易被混合菌懸液降解的小分子烴類幾乎全部揮發。另外，細菌蛋白質、核酸、細胞壁和細胞膜及酶類因熱力作用發生變性或凝固，活性消失，代謝發生障礙，導致細菌死亡，且當外界溫度明顯高于細菌的最適生長溫度，細菌可能更易被殺死。因此，當溫度過高時，混合降解菌降解的汽油量遠遠低于汽油揮發的量。由此可知，溫度過高或者過低均會導致混合菌懸液對汽油污染土的降解率下降。

3）含水率

土壤濕度是影響微生物降解石油烴的主要環境因素之一。微生物的新陳代謝均需要水分來維持，但濕度過高又會導致土壤空隙變小，通透性和氧氣供給不足。此外，土壤中的水分會在土壤顆粒表面形成水膜，降低污染物在土壤顆粒上的吸附，增加微生物與污染物的接觸幾率，提高降解效率。土壤含水率對汽油污染土降解率的影響如圖4所示。

由圖4可以發現，當土壤含水率由0升高到15%時，降解菌的降解率增長速率較快，由此可知，水分是降解菌降解不可或缺的因素。隨著土壤含水率的不斷升高，降解率曲線增長逐漸趨于平緩，當含水率為25%時，降解率曲線出現一個快速下降的轉折點，分析原因可能是土壤含水率超過土壤液限，含水率過高導致土壤空隙變小，通透性和氧氣供給不足。由圖中含水率為0%的試驗組與后面含水率不為0試驗組汽油污染土的降解率比較可知，含水率對降解效果影響較大。

4）降解菌接種量

當初始接種少量的微生物時，初始的降解效果可能不太明顯，但隨著后期微生物的生長繁殖，微生物的降解效果會逐漸明顯，由于試驗設計的降解環境為一個總營養物質為定量的土壤環境，總的降解效果可能很理想。當初始接種大量的微生物時，則初始降解效果會很明顯，但隨著后期菌體的過度繁殖，菌體對土壤中營養物質的相互競爭將導致營養物質短缺，致使微生物的新陳代謝和生長速率減緩，影響了混合菌懸液對石油烴的吸收降解，可能導致總的降解效果不是很理想。因此，對于降解菌總的降解效果還需對最佳降解菌接種量進行測定。降解菌接種量對汽油污染土降解率的影響如圖5所示。

由圖5可以發現，當混合降解菌接種量為0時，汽油污染土的降解率為0，這與已有的研究結果不符，原因可能是在對未受污染的土壤進行預處理時，將土壤放于溫度為105 ℃的烘干箱中烘干時，汽油污染土中的土著微生物均被高溫殺死。當混合降解菌接種量為0.3 mL時，汽油污染土的降解率為29.2%，并且在混合降解菌接種量達到2 mL前，隨混合降解菌接種量的不斷增加，汽油污染土的降解曲線呈上升趨勢。因此，若想通過微生物修復方式取得相對明顯的降解效果則需要人為投放高效降解菌。當降解菌接種量在0～1 mL范圍內時，隨降解菌接種量逐漸增大，混合菌懸液對汽油污染土的降解率增長速率較快。但在降解菌接種量大于2 mL后，隨降解菌接種量不斷增大，降解率開始逐漸減小。

2.2.2 多因素正交試驗

根據單因素試驗結果，當pH值在6～8、降解溫度在30～35 ℃、含水率在15%～25%和降解菌接種量在1～2.5 mL范圍內時，混合菌懸液的降解效果相對明顯。因此，選取6.5、7、8這3個pH值水平，30、32、35 ℃這3個培養溫度水平，1、2、2.5 mL這3個降解菌接種量水平和15%、20%、25%這3個含水率水平作為四因素三水平正交試驗的試驗條件，采用L9（34）正交表安排試驗方案。表1為四因素三水平正交表及試驗結果。

為了進一步分析多因素正交試驗中不同條件下混合降解菌對汽油污染土降解率的變化趨勢，圖6給出了多因素正交試驗降解率的折線圖。

由圖6可以發現，正交試驗組編號為2和8兩組的降解率相對較高，均超過60%。正交試驗組編號為2的降解條件為降解菌接種量為1 mL、pH值為7、降解溫度為32 ℃、土壤含水率為20%，混合菌懸液對汽油污染土的降解率為63.12%;正交試驗組編號為8的降解條件為降解菌接種量為2.5 mL、pH值為7、降解溫度為30 ℃、土壤含水率為25%，降解率最高可達60.28%。由圖6可知，無論是溫度因素還是混合降解菌接種量因素均未表現出對汽油污染土的降解率有明顯的影響。因此，為了進一步比較各因素水平對汽油污染土降解率的影響水平，圖7給出了混合菌懸液對汽油污染土的降解率的極差分析圖（縱坐標為降解率極差的平均值，橫坐標為各個因素水平）。

從圖7可知，降解菌接種量為A1、pH值為B2、溫度為C2、含水率為D3分別為各因素的最優降解水平。綜上所述，混合菌懸液對汽油污染土降解的最優條件是A1B2C2D3，即當降解菌接種量為1 mL、pH值為7、降解溫度為32 ℃和含水率為25%時，混合菌懸液對汽油污染土的降解效果達到最佳狀態。

3 結論

1）利用實驗室提取的5種降解菌對汽油污染土進行降解試驗，通過對比試驗前后有機物組分發現，5種降解菌的混合菌懸液對汽油污染土有良好的降解能力。

2）單因素試驗條件下，當pH值在6～8、降解溫度在30～35 ℃、含水率在15%～25%和降解菌接種量在1～2.5 mL范圍內時，混合菌懸液對汽油污染土的降解效果相對明顯。

3）多因素正交試驗條件下，當溫度為32 ℃、pH值為7、降解菌接種量為1 mL和含水率為25%時，混合菌懸液對汽油污染土的降解效果最佳。

由于實驗室環境下篩選馴化的高效優勢微生物菌株在實際污染的土壤環境中可能不能完全發揮其有效活性。因此，為了得到本文石油烴混合降解菌對于實際汽油污染土壤的降解效果，需要進行田間的修復試驗并優化，以用于實際工程。

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（編輯 王秀玲）

收稿日期：2019-10-08

基金項目：? 重慶社會事業與民生保障科技創新專項（cstc2017shms-zdyfX0073）;國家自然科學基金（51978103、41831282）

作者簡介：? 曹小方（1991- ），女，主要從事環境巖土工程微生物修復技術研究，E-mail：cxf120368881@163.com。

方祥位（通信作者），男，博士，教授，博士生導師，E-mail：fangxiangwei1975@163.com。

Received： 2019-10-08

Foundation items：? Scientific and Technological Innovation for Social Undertaking and Peoples Livelihood Guarantee in Chongqing （No. cstc2017shms-zdyfX0073）; National Natural Science Foundation of China（No.51978103， 41831282）

Author brief：? Cao Xiaofang （1991- ）， main research interest： microbial remediation technology in environmental geotechnical engineering， E-mail： cxf120368881@163.com.

Fang Xiangwei （corresponding author）， PhD， professor， doctorial supervisor， E-mail： fangxiangwei1975@163.com.