分離自1例COPD患者的Aspergillus lentulus菌株對蠟螟幼蟲生存率、體表黑色素化及活動度的影響

姬名碩，王曉東，美日哈巴·阿西木，張麗娟，夏日克亞·玉素甫江，帕麗達·阿布利孜

新疆醫科大學第一附屬醫院，烏魯木齊 830054

近年來，侵襲性真菌感染(IFI)患者逐年增多，目前已成為許多疾病致病和致死的重要病因[1]。盡管IFI的診斷技術和治療手段取得了一定的進展，但侵襲性曲霉菌病患者經治療后病死率仍>50%[2,3]。近年來，IFI的真菌譜也在發生變化，以往常見的白色念珠菌感染呈下降趨勢[4]，而以往不常見的曲霉菌感染比例上升[5]。新的曲霉菌株也不斷出現，比如曲霉屬的新種A.lentulus、A.udagawae、A.viridinutans、A.thermomutatus。在這些新曲霉菌中，文獻報道最多的就是煙曲霉菌的姊妹菌A.lentulus，然而目前對該菌的毒力、流行率和發病機制尚不清楚[6]。為探究A.lentulus的毒力，我們把1例慢性阻塞性肺疾病(COPD)老年男性患者痰標本中分離出的A.lentulus為觀察對象，并以A.lentulus標準菌株、煙曲霉菌、白色念珠菌作對照，將各菌株分別感染蠟螟幼蟲，并比較蠟螟幼蟲的生存率、黑色素化、活動度，旨在評價A.lentulus的毒力強弱，為探索更有效的IFI治療方法提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源、培養、分離及菌懸液配置A.lentulus患者菌株(菌號：XYZ 10188，由2011年新疆醫科大學第一附屬醫院收治的1例患有5年COPD的老年男性患者痰標本中分離)、A.lentulus標準菌株(菌號：XYZ 10192)、煙曲霉菌(菌號：XYZ10110)、白色念珠菌(菌號：XYZ9013)均來自新疆醫科大學第一附屬醫院皮膚科實驗室。上述各菌分別接種在MEA 9 cm培養皿中，37 ℃培養生長。A.lentulus培養9 d(本研究預實驗顯示A.lentulus9 d后毒力較強)，煙曲霉菌、白色念珠菌培養4 d，之后開始配制菌懸液。每株菌用滅菌的10 μL的PBS液進行3次的菌苔洗脫。用干凈棉棒輕輕擦拭菌落表面，盡可能多的將菌落中孢子洗脫至PBS中，用移液器將菌液轉入帶有玻璃棉的注射器過濾到收集管中。用白細胞計數板(25×16型計數板)在顯微鏡下計數孢子數量，并計算菌液濃度，孢子數/mL=80個小格的孢子總數/80×400×10 000×稀釋倍數，得到濃度除以所需要的濃度即為稀釋倍數，稀釋后的菌液即為所得濃度。

1.2 蠟螟幼蟲分組、菌株注射方法及蠟螟幼蟲生存、體表黑色素化、活動度觀察 選取體表顏色發白的蠟螟幼蟲70只，并分為7組，均給予400 μL相應菌株或PBS，A組每只蠟螟幼蟲右側尾足處注射1×104CFU的A.lentulus患者菌株，B組每只注射1×105CFU的A.lentulus患者菌株，C組每只注射1×106CFU的A.lentulus患者菌株，D組每只注射1×106CFU的A.lentulus標準菌株，E組每只注射1×106CFU的煙曲霉菌，F組每只注射1×106CFU的白色念珠菌，G組每只注射PBS。每組中的每個菌測試10只蠟螟幼蟲，每5只蠟螟幼蟲分別分裝在2個鋪有濾紙的9 cm的干凈培養皿中備用。將各組蠟螟幼蟲放入37 ℃培養箱中培養72 h，記錄感染0、2、18、24、48、72 h蠟螟幼蟲的生存率，參照文獻[7,8]的體表黑色素化及活動度評分標準評價上述各時點蠟螟幼蟲的體表黑色素化情況及活動度。

2 結果

2.1 各組不同時點蠟螟幼蟲生存率 不同時點蠟螟幼蟲生存率見表1。由表1可知，A組在觀察時間段內，0 h生存率最高，在24 h開始發生死亡，生存率降至96.67%，48、72 h生存率未發生明顯變化與24 h時相同，生存率最低(P均>0.05)。B組結果與A組相同。C組在觀察時間段內，0 h生存率最高，在18 h開始發生死亡，生存率降至約66.67%，隨著時間的推移生存率逐漸降低，在72 h生存率最低約為20.00%(P均<0.05)。D組0 h生存率最高，在18 h開始發生死亡，生存率降至96.67%，隨著時間的推移生存率逐漸降低，在72 h生存率最低約為36.67%(P均<0.05)。E組在0 h生存率最高，在18 h開始發生死亡，生存率降至20.00%，在24 h內全部死亡(P均<0.05)。F組在0 h生存率最高，在18 h開始發生死亡，生存率降至60.00%，在24 h內全部死亡(P均<0.05)。G組在觀察時間段內，在0 h生存率最高，在24 h開始發生死亡，生存率降至96.67%、隨著時間的推移生存率逐漸降低，在72 h生存率最低約為93.33%(P均>0.05)。在18、24、48、72 h，7組整體比較都具有統計學差異(P均<0.05)。不同濃度A.lentulus比較，在18、24、48、72 h，A、B組比較，P均>0.05，A、C組比較，B、C組比較，P均<0.05。不同菌株間比較，在18 h時，C、D組比較，P均>0.05；24、48、72 h時，C、D組比較，P均<0.05。18、24、48、72 h，C組分別與E、F組比較，P均<0.05。在18 h時，E組與F組比較，P>0.05。18、24 h時，C、E、F組與G組比較，P均<0.05。在48、72 h，C、D、E、F組與G組比較，P均<0.05。

表1 各組不同時點蠟螟幼蟲生存率

2.2 各組不同時點蠟螟幼蟲體表黑色素化評分 不同時點蠟螟幼蟲體表黑色素化評分見表2。由表2可知，A組在觀察時間段內，0 h體表黑色素化評分最高，在2 h開始下降，48 h降至最低(P均>0.05)。B組在觀察時間段內，0 h體表黑色素化評分最高，在2 h開始下降，72 h降至最低(P均>0.05)。C組在觀察時間段內，0 h體表黑色素化評分最高，在2 h開始下降，72 h將至最低(P均<0.05)。D組在觀察時間段內，0 h體表黑色素化評分最高，在2 h開始下降，72 h降至最低(P均<0.05)。E組在觀察時間段內，0 h體表黑色素化評分最高，在2 h開始下降，24 h內蠟螟全部死亡，評分降至最低(P均<0.05)。F組在觀察時間段內，0 h體表黑色素化評分最高，在2 h開始下降，24 h內蠟螟全部死亡，評分降至最低(P均<0.05)。G組在觀察時間段內，0 h體表黑色素化評分最高，在18 h開始下降至最低評分后，隨著觀察時間增加未發生變化(P均>0.05)。在0 h時，7組整體間比較未見統計學差異(P均>0.05)。在2、18 h、24、48、72 h，7組整體比較都具有統計學差異(P均<0.05)。不同濃度A.lentulus比較，在2、18、24、48、72 h，A、B組比較，P均>0.05;A、C組比較，B、C組比較，P均<0.05。不同菌株間比較，在2、18、24、48、72 h，C、D組比較，E、F組比較，P均>0.05；C組分別與E、F組比較，P均<0.05。2、18、24、48、72 h時，A、B組與G組比較，P均>0.05。在2、18 h，C、D組與G組比較，P均>0.05；在24、48、72 h，C、D組與G組比較，P均<0.05。在2、18、24、48、72 h，E、F組與G組比較，P均<0.05。

表2 各組不同時點蠟螟幼蟲體表黑色素化評分(分，

2.3 各組不同時點蠟螟幼蟲活動度評分 不同時點蠟螟幼蟲活動度評分見表3。由表3可知，A組在觀察時間段內，活動度評分未發生明顯變化，在0 h活動度評分最高，在48 h開始下降至最低評分，72 h未發生變化(P均>0.05)。B組變化結果和A組類似。C組在觀察時間段內，0 h活動度評分最高，在2 h開始下降，72 h將至最低(P均<0.05)。D組在觀察時間段內，0 h活動度評分最高，在18 h開始下降，72 h降至最低(P均<0.05)。E組在觀察時間段內，0 h活動度評分最高，在2 h開始下降，24 h蠟螟全部死亡，評分降至最低(P均<0.05)。F組在觀察時間段內，0 h活動度評分最高，在2 h開始下降，18 h蠟螟全部死亡，降至最低(P均<0.05)。G組在觀察時間段內，0 h評分最高，在18 h開始下降至最低評分后，隨著觀察時間增加未發生變化(P均>0.05)。在2、18、24、48、72 h，7組整體比較都具有統計學差異(P均<0.05)。不同濃度A.lentulus比較，在2、18、24、48、72 h，A、B組比較，P>0.05，A、C組比較，B、C組比較，P均<0.05。不同菌株間比較，在2、18、24、48、72 h，C、D組比較，E、F比較，P均>0.05；C組分別與E、F組比較，P均<0.05。2、18、24、48、72 h時，A、B組與G組比較，P均>0.05。在2、18 h，C、D組與G組比較，P均>0.05。在24、48、72 h，C、D組與G組比較，P均<0.05。在2、18、24、48、72 h，E、F組與G組比較，P均<0.05。

表3 各組不同時點蠟螟幼蟲活動度評分比較(分，

3 討論

蠟螟幼蟲模型最初應用于細菌病原體中[9,10]，近年已擴展到真菌，病毒等病原體中并取得了一定進展[11]。蠟螟幼蟲作為小型哺乳動物(如小鼠和大鼠)的替代宿主模型該模型，已運用于宿主與病原體的相互作用的研究，不僅限于研究真菌感染的發病機理和抗真菌藥物的作用機理，也可用于宿主防御真菌病原體的研究[12～15]，病原體對藥物的敏感度、藥物毒力研究[16～18]。昆蟲免疫反應在結構和功能上與哺乳動物先天免疫反應具有相似性，尤其是蠟螟幼蟲血細胞和哺乳動物中性粒細胞都具有吞噬并殺死病原體的作用[19]，并且在免疫應答過程中可發生體表黑色素化更加有利于實驗觀察。基于以上蠟螟動物感染模型的特點，本實驗采用蠟螟作為A.lentulus毒力的初步研究有一定的基礎支持及研究價值。

A.lentulus是Balajee等于2005年在4例造血干細胞移植患者分泌物中分離鑒定并作為煙曲霉菌的姊妹菌而成為新紀錄菌[1]。此后由于人們對A.lentulus認識的不斷提高，日本[20]、巴西[21]、瑞士[22]、西班牙[23]、阿根廷[24]、土耳其[25]等一些國家醫學家已經在接受心、肝、腎器官移植患者、慢性阻塞性肺氣腫患者、囊性纖維化等患者的支氣管肺泡灌洗液，痰液標本中分離到A.lentulus，盡管A.lentulus是煙曲霉菌的姊妹菌，但是與煙曲霉菌相比具有獨特之處，如培養菌落呈現白色棉絮狀，產孢少，有小分生孢子頭，溫度超過48 ℃不能生長，KOH直接鏡檢可見粗大有分隔分叉的透明菌絲。A.lentulus用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)分離培養基在37 ℃下培養2周，可見灰白色絨毛狀菌落，背面呈現灰白色或灰白色，鏡下可見分生孢子頭。煙曲霉菌及白色念珠菌作為臨床真菌學中最常見、研究最深入的真菌，而A.lentulus是煙曲霉菌的姊妹菌，以煙曲霉菌作為對照更能突出A.lentulus在煙曲霉菌菌屬中毒力的強弱。本研究顯示，蠟螟幼蟲生存指標呈濃度依賴性，A組各項生存指標較B、C組下降明顯。各組菌株感染的蠟蟲生存指標隨著觀察時間的延長而呈下降趨勢。同一時段不同菌株間生存指標比較，A、B、C組生存率下降較D組慢，體表黑色素化及活動度評分兩者比較無統計學差異；A、B、C組各生存指標較E、F組下降慢。

總之，A.lentulus患者菌株對蠟螟生存率、體表黑色素化、活動度的影響均較白色念珠菌和煙曲霉菌弱，對蠟螟生存率的影響較A.lentulus標準菌株弱，對黑化作用及活動度的影響與A.lentulus標準菌株相當。