RMPP患兒血清相關(guān)炎癥因子及外周血白細(xì)胞TLR-2/MyD88/NF-κB通路mRNA、蛋白表達(dá)觀察

胡景偉，楊淑蘭

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)赤峰臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰 024000

2016年肺炎造成92萬5歲以下兒童死亡，其中98%來自發(fā)展中國家，肺炎也是當(dāng)前我國5歲以下兒童死亡的主要原因之一[1]。難治性肺炎支原體肺炎(RMPP)是指肺炎支原體肺炎(MPP)患兒經(jīng)正規(guī)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療后仍持續(xù)發(fā)熱，臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)持續(xù)加重者，短期內(nèi)可出現(xiàn)肺內(nèi)及肺外并發(fā)癥，是造成兒童患慢性氣道疾病、影響生命質(zhì)量的重要原因[2]。研究[2]顯示，機(jī)體免疫功能紊亂引起的異常炎癥反應(yīng)是RMPP發(fā)生的主要機(jī)制之一。肺炎支原體(MP)細(xì)胞膜上的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白經(jīng)免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體(TLRs)識別后，在各種酶的作用下，激活絲裂原蛋白激酶以及各種轉(zhuǎn)錄因子，最終誘導(dǎo)其分泌炎癥因子。TLRs是能夠參與免疫反應(yīng)的一類重要蛋白質(zhì)分子，它們可以識別入侵的病原體，然后通過TLRs胞內(nèi)區(qū)Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域與髓樣分化因子88(MyD88)羧基端結(jié)合，再通過MyD88氨基端的死亡結(jié)構(gòu)域進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而激活核因子κ-B(NF-κB)誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)和分泌[3,4]。本研究觀察了RMPP患兒血清相關(guān)炎癥因子[干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、半胱氨酰白三烯(CysLTs)、單核細(xì)胞趨化蛋白4(MCP-4)]以及外周血白細(xì)胞TLR-2/MyD88/NF-κB通路基因[Toll樣受體-2(TLR-2)、髓樣分化因子88(MyD88)、核因子-B(NF-κB)]mRNA和蛋白的改變，并探討RMPP的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年10月～2018年10月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)赤峰臨床醫(yī)學(xué)院收治的RMPP患兒25例(難治組)，男15例，女10例；年齡(5.94±3.46)歲。MPP患兒25例(普通組)，男9例，女16例；年齡(4.63±2.50)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①RMPP：符合MPP診斷標(biāo)準(zhǔn)，單用大環(huán)內(nèi)酯類常規(guī)治療1周后，仍表現(xiàn)有持續(xù)高熱，咳嗽、胸痛等癥狀無明顯改善，胸部X線片或胸部CT示病灶范圍變大，出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)大片、高密度肺實(shí)變影，或出現(xiàn)中、大量胸腔積液，甚至出現(xiàn)壞死性肺炎或彌散性間質(zhì)性肺浸潤等表現(xiàn)[2]；②MPP：有發(fā)熱和呼吸道癥狀，胸部X線正位片示有肺炎表現(xiàn)、實(shí)變陰影，血清MP特異性IgM抗體陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①過敏性疾病：如蕁麻疹、過敏性鼻炎、哮喘等；②免疫性疾病：系統(tǒng)性紅斑狼瘡，青少年糖尿病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；或近期使用糖皮質(zhì)激素者；③家屬拒絕。另選25例健康體檢兒童作對照(對照組)，男14例，女11例；年齡(5.80±3.80)歲。本實(shí)驗(yàn)已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，所有研究對象均征得監(jiān)護(hù)人同意并簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本取材 取就診時或住院第2天晨起抽取靜脈血2 mL置于抗凝管中，4 ℃條件下以轉(zhuǎn)速3 000 r/min速度離心10 min，分離到的血清(用于檢測IFN-γ、IL-8、CysLTs、MCP-4)及白細(xì)胞(用于檢測TLR-2、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白)分裝在無菌EP管內(nèi)，-80 ℃儲存。

1.3 血清IFN-γ、IL-8、CysLTs、MCP-4檢測方法 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(ELISA)法檢測血清中IFN-γ、IL-8、CysLTs、MCP-4，試劑盒購自南京信帆生物有限公司，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。

1.4 外周血白細(xì)胞TLR-2、MyD88、NF-κB mRNA檢測方法 采用RT-PCR法。①RNA的提取：按試劑盒說明書(Thermo，15596026)步驟分離總RNA，測光密度(OD)值定量RNA濃度。②cDNA的合成：按照TaKaRa公司的PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，合成cDNA模板。③PCR擴(kuò)增：參照GenBank中目的基因mRNA序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物(由南京德亨文生物科技有限公司合成)，取1 μL cDNA為模板，加入引物，放入PCR擴(kuò)增儀，擴(kuò)增條件如下：a.95 ℃預(yù)變性3 min；b.94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，28個循環(huán)；c.12 ℃ ∞。④電泳檢測：1%瓊脂糖，1×ATE緩沖液，90V電泳30 min，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描電泳圖像，用Image J軟件對各條帶OD值進(jìn)行定量分析，待測基因與相應(yīng)內(nèi)參OD比值作為mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 外周血白細(xì)胞TLR-2、MyD88、NF-κB蛋白檢測方法 采用蛋白印跡法。①血液樣本蛋白提取參考血液蛋白快速提取試劑盒(BestBio)，具體過程按說明書進(jìn)行。②蛋白濃度定量：樣品蛋白濃度測定通過BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒完成。③電泳、轉(zhuǎn)膜和孵育：每個樣品總蛋白上樣量均為40 μg。按照濃縮膠80 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳，待蛋白分離完全，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜。在轉(zhuǎn)好的膜中加入封閉液，室溫下封閉60 min。加入一抗4 ℃條件下過夜，回收一抗，用TBST洗滌后再加入二抗，于室溫下孵育30 min。④檢測：滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)龋诎凳抑衅毓狻Ｒ設(shè)D值和標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照樣品OD值獲取對應(yīng)樣品濃度。再用稀釋倍數(shù)乘以樣品濃度，即可得到樣品的實(shí)際濃度。

2 結(jié)果

2.1 各組血清IFN-γ、CysLTs、IL-8、MCP-4水平比較 血清IFN-γ、CysLTs、IL-8、MCP-4水平比較見表1。

表1 各組血清IFN-γ、CysLTs、IL-8、MCP-4水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與普通組比較，bP<0.05。

2.2 各組外周血TLR-2、MyD88及NF-κB mRNA及蛋白比較 外周血TLR-2、MyD88及NF-κB mRNA及蛋白比較見表2。

表2 各組外周血TLR-2、MyD88及NF-κB mRNA及蛋白比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與普通組比較，bP<0.05。

3 討論

MPP是兒童社區(qū)獲得性肺炎的重要組成部分，MP感染屬于自限性疾病，但部分MPP經(jīng)正規(guī)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療1周及以上，仍持續(xù)發(fā)熱，臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)加重者，稱之為RMPP[2]。RMPP常見于年長兒，發(fā)熱時間及住院時間較長，胸部影像學(xué)進(jìn)行性加重，可出現(xiàn)胸腔積液、肺壞死及肺膿腫形成等肺部并發(fā)癥。除呼吸系統(tǒng)外，RMPP還可以常在短時間內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及循環(huán)系統(tǒng)功能障礙。RMPP的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前認(rèn)為MP感染機(jī)體后導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子過度釋放，產(chǎn)生過強(qiáng)的組織損傷，所以免疫功能紊亂在RMPP的發(fā)病中起重要作用[2,5]。

INF-γ是先天性及獲得性免疫中至關(guān)重要的促炎細(xì)胞因子，可以激活巨噬細(xì)胞，并加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，清除病原體。研究[6,7]發(fā)現(xiàn)，RMPP患兒血清中檢測到了高濃度的INF-γ，可以提示組織損傷的嚴(yán)重性。CysLTs能夠促進(jìn)以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞向氣道遷移，導(dǎo)致氣道平滑肌收縮，是一種強(qiáng)效的致支氣管收縮因子和促炎因子。Andrews等[8]發(fā)現(xiàn)，MP感染的患兒血中CysLTs水平高于健康對照組。IL-8在炎性反應(yīng)中發(fā)揮促炎作用，可以激活中性粒細(xì)胞并趨化其遷移至炎癥部位，釋放多種活性產(chǎn)物，加重炎癥反應(yīng)。管敏昌等[9]認(rèn)為，IL-8是RMPP炎癥反應(yīng)中的重要因子，在一定程度上與炎癥的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。MCP-4由單核細(xì)胞及上皮細(xì)胞產(chǎn)生的強(qiáng)力趨化蛋白，也可將Th2細(xì)胞聚集至炎癥部位引起免疫損傷，造成進(jìn)一步損害。國內(nèi)學(xué)者研究[10]表明，普通組患兒血清MCP-4水平顯著高于對照組。本研究顯示，難治組患兒血清中IFN-γ、CysLTs、IL-8、MCP-4水平明顯升高，與上述研究一致。

TLRs識別入侵的病原體后募集MyD88，進(jìn)而在多種蛋白激酶的作用下激活NF-κB，激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核[11,12]，誘導(dǎo)IL-8、IFN-γ、CysLTs等多種炎癥因子的合成和分泌[13,14]。目前已發(fā)現(xiàn)的TLRs共11種，TLR-2可以直接識別MP膜脂蛋白[15]，且TLR-2在正常人氣道上皮及支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)很低，當(dāng)病原體入侵機(jī)體時表達(dá)上調(diào)。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，MPP患兒血清TLR-2的表達(dá)明顯增高，并與MP抗體滴度呈正相關(guān)，MP感染TLR-2缺陷的小鼠不能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和氣道上皮黏蛋白的產(chǎn)生[11]；MyD88是一種重要的接頭蛋白，是大部分TLRs的銜接蛋白，靜息時以結(jié)合蛋白非活性的形式存在于免疫細(xì)胞中。當(dāng)配體出現(xiàn)時，MyD88從結(jié)合蛋白中分離出來，其羧基端被激活。動物實(shí)驗(yàn)研究表明：MyD88基因缺陷的小鼠在肺炎衣原體感染時無法上調(diào)促炎因子和趨化因子，不能向肺部募集適當(dāng)?shù)拿庖呒?xì)胞清除病原體，引發(fā)慢性肺部炎癥和更高的病死率。Chu等[11]發(fā)現(xiàn)，MP感染后的小鼠血清中TLR-2的mRNA和蛋白增加，MyD88向TLR-2的募集增加，NF-κB的活性也顯著增加。NF-κB是一種廣泛存在的快速作用轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞反應(yīng)和炎癥基因的表達(dá)。NF-κB的活化是重癥肺炎疾病過程的重要環(huán)節(jié)，其早期活化對病原體的清除和機(jī)體防御起重要作用，但是過度激活則會導(dǎo)致過強(qiáng)的免疫反應(yīng)使病情加重病程延長。本研究顯示，難治組TLR-2、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平均較普通組及對照組高，提示其可能在RMPP發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

總之，RMPP患兒血清IFN-γ、CysLTs、IL-8、MCP-4水平升高，外周血TLR-2、MyD88、NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)升高。