急性運動對人體唾液和尿液分泌型免疫球蛋白A的影響

劉志剛 ，張朝會 ，向家俊

（1.重慶三峽學院 體育與健康學院，重慶 404130；2.玉溪師范學院 體育學院，云南 玉溪 653100）

粘膜免疫系統（Mucosal immune system，MIS）是指廣泛分布于呼吸道、消化道、泌尿生殖道粘膜下及一些外分泌腺如淚腺、唾液腺導管等粘膜部位的淋巴組織，是執行局部特異性免疫功能的主要場所，是機體整個免疫網絡的重要組成部分。粘膜表面與外界抗原直接接觸，是機體抵抗感染的第一道防線，在抗感染方面起著極為重要的作用。粘膜免疫系統同樣包括體液免疫和細胞免疫兩大類，并以體液免疫過程為主，即分泌抗體是粘膜免疫抵御外界抗原的主要方式。

分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin A，SIgA）是由機體黏膜表面的B細胞分泌的抗體，大量存在于黏膜表面和黏膜分泌液中（如唾液、乳汁、淚液、痰液、消化液），是機體黏膜免疫的主要免疫球蛋白，對各種內源共生菌及外源入侵的病原體都有抵抗作用。且經抗原刺激后粘膜抗體 （以SIgA為主）比血清抗體出現的早，效價維持時間長，是機體非特異性免疫的第一道防線，在抵抗感染過程中具有極重要的作用［1-2］。SIgA由漿細胞產生，由J-鏈連接成二聚體的形式分泌至粘膜表面。當IgA通過粘膜或漿膜上皮細胞向外分泌時，與上皮細胞產生的分泌片（secretory component，SC）連接成完整的 SIgA，釋放到分泌液中，與上皮細胞緊密連接在一起，分布在粘膜或漿膜表面發揮免疫作用。因此一個完整的SIgA分子通常有2個IgA單體，1條J鏈和1個分泌片構成。（圖1）J鏈是一種酸性蛋白，含二硫鍵（-s-s-）連接的2個半胱氨酸殘基以及IgA特定的分子殘基。而SC則是多聚IgA的受體，能與IgA的亞甲基（-CH2-）之間以二硫鍵結合［3］。破壞該二硫鍵可以把SC從SIgA上分離下來。由于IgA單體有2個抗原結合位點，因此每個SIgA分子有4個抗原結合位點，即四價抗體。并介導吞噬細胞對病原或其他抗原的吞噬過程，從而起到對病原的免疫殺傷作用。（圖2）通過SIgA介導的免疫過程可能是運動增強機體免疫力的機制之一。而國內有關的研究報道很少，本文以24名青年大學生為實驗對象，研究不同強度單次急性運動干預下對人體唾液和尿液中SIgA的變化。

圖1 SIgA（二聚體）結構示意圖

圖2 抗體介導的吞噬細胞吞噬抗原過程

1 實驗方案

1.1 實驗對象及分組

24名男性在校二年級大學生，年齡19±0.5歲，身高170±3cm，體重60±5kg，隨機分為低強度運動組（low intensity exercise group，LIE）、中等強度運動組（moderate intensity exercise group，MIE）、 高 強 度運動組 （high intensity exercise group，HIE），并以這3組受試者運動前安靜狀態下的唾液和尿液SigA含量作為基準值對照。

1.2 運動方案

表1 各組受試者運動方案

如表1所示，低強度運動：靶心率設定為120次/min，受試者運動持續10min，靶心率維持時間≥7min；中等強度運動：靶心率設定為140次/min，受試者運動持續10min，靶心率維持時間≥7min；高強度運動：靶心率設定為≥180次/min，受試者運動持續10min，靶心率維持時間≥5min。運動在標準塑膠田徑場以跑步的形式進行，每組8人。測試在上午10：00~11：00，早餐后2h進行。以減少消化系統對運動的影響。測試點海拔1 700m，環境溫度25℃，濕度60%，天氣晴朗，微風。對受試者進行基礎培訓，以藍牙心率帶和心率表監測運動中心率變化，并囑咐其盡可能地把運動心率維持在靶心率附近。

1.3 標本采集和測試

在運動前5min采集每組受試者自然分泌的唾液和前段尿各1mL，標記后立即置于-20℃冰盒中保存。待完成運動方案后，即刻再次采集受試者自然分泌的唾液和前段尿各1mL（MIE、HIE組運動完畢唾液分泌減少，采集有困難者，允許其閉口主動用力吮吸促進唾液分泌，以達到唾液采集量要求）。標記后于-20℃冰盒中保存待測。

1.4 主要測試儀器

酶標分析儀（Rayto RT-6100，美國產）；

高速冷凍離心機（賽特湘儀GL-2050MS，中國產）；

移 液 器 （Eppendorf 0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL，德國產）；

-20℃冰箱（美的BCD-231WTM，中國產）；

37℃恒溫箱（北京福意FYL-YS-150L，中國產）；

藍牙心率表（POLAR RC3 GP，芬蘭產）；

運動秒表（CASIO HS-80TW，日本產）。

2 測試過程

2.1 測試方法和原理

采用上海江萊生物提供的人分泌型免疫球蛋白A（SIgA）酶聯免疫吸附測定試劑盒，在Rayto RT-6100酶標分析儀上進行。實驗原理：采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人分泌型免疫球蛋白A（SIgA）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人分泌型免疫球蛋白A（SIgA）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

2.2 試劑盒性能

檢測范圍：1.5μg/mL～48μg/mL。

靈敏度：最低檢測濃度小于0.1μg/mL。

特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

重復性：板內變異系數小于10%，板間變異系數小于15%。

2.3 測試步驟

1）提前20min從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2）從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出微孔酶標板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

3）設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50μL。

4）樣本從冰箱取出后平衡至室溫 20℃，1 000g離心20min取上清待測。

5）樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

6）除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃恒溫箱溫育60min。

7）棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。

8）每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。

9）每孔加入終止液 50μL，15min內，在 450nm波長處測定各孔的OD值。

2.4 利用標準曲線和回歸方程計算結果

在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本SIgA含量。

3 測試結果

表2 各組唾液和尿液SIgA運動后變化情況

唾液各組數據進行正態性檢驗 （Normality Test，p=0.847＞0.05）和方差齊性檢驗（Equal Variance Test，p=0.287＞0.05），具備方差分析條件，進行單因素方差分析。唾液SIgA含量與基準 值 （95%CI，7.57-8.41） 比 較 ，MIE 組 極 顯 著 升 高 （p＜0.001，95%CI，9.02-13.02），HIE 組極顯著升高 （p＜0.001，95%CI，9.66-11.95），LIE 組無顯著性差異 （p=0.918＞0.05，95%CI，6.53-9.36）；與 LIE 組比較，MIE 組極顯著升高（p＜0.001），HIE組極顯著升高（p＜0.001）；與 MIE組比較，HIE組無顯著性差異（p=0.711＞0.05）

尿液各組數據進行正態性檢驗 （Normality Test，p=0.270＞0.05）和方差齊性檢驗（Equal Variance Test，p=0.877＞0.05），具備方差分析條件，進行單因素方差分析。尿液SIgA含量與基準值 （95%CI，8.86-9.72）比較，LIE 組（p=0.001＜0.01，95%CI，9.98-11.69）、MIE 組 （p=0.002＜0.01，95%CI，9.63-11.86）、HIE組 （p=0.004＜0.01，95%CI，9.20-11.95） 全部具有極顯著性差異，LIE 組與 MIE 組 （p=0.852＞0.05）、LIE 組與 HIE 組 （p=0.598＞0.05）、MIE 組與 HIE 組（p=0.732＞0.05）之間無差異顯著性。

唾液基準值與尿液基準值2組數據進行T檢驗比較，尿液SIgA基準值顯著高于唾液SIgA基準值（p=0.002＜0.01）

4 討論

多數學者的研究顯示，急性或長期的中低強度運動對細胞免疫和體液免疫有促進作用，而大強度運動則可能會通過氧化應激［4-5］、免疫細胞凋亡［6］、激素分泌（糖皮質激素、兒茶酚胺、促腎上腺皮質激素、促腎上腺皮質激素釋放激素、生長抑素）、T細胞亞群 Th/Ts改變和細胞因子 TGF-β、IL-10、IL-35表達增加傾向于抑制機體的免疫能力［7-10］。

而運動同樣會顯著影響機體的粘膜免疫能力。粘膜免疫作為人體免疫的第一道屏障，對預防外源性感染起著十分重要的作用。其中比較常見的是急性上呼吸道感染 （upper respiratory tract infection，URTI）。研究發現大強度運動使運動員患URTI幾率上升，不僅與大強度運動抑制體液免疫和細胞免疫有關，與運動導致的粘膜免疫變化同樣關系密切，而體液免疫又是粘膜免疫的主要形式。表2結果顯示，單次急性低強度運動對唾液SIgA無顯著影響，而急性中等強度和急性大強度運動均顯著提高受試者唾液SIgA含量。與MIE組相比，HIE組受試者唾液SIgA有降低的趨勢，雖不具有顯著性差異，但根據運動免疫的已有理論，推測運動強度與唾液SIgA水平仍可能存在一個類似“倒U型”的關系，這也意味著單次大強度運動可能會增加粘膜免疫抑制的風險。

單次急性低、中、高強度運動均顯著提高尿液SIgA含量。但與唾液不同的是，尿液SIgA升高的幅度，隨運動強度增大而減少，但LIE、MIE和HIE之間同樣無統計學差異。與各自的基準值來看，尿液SIgA基準水平高于唾液，但運動后各組的變化幅度小于唾液，這可能是由于尿從腎臟生成經過輸尿管、膀胱、尿道排出體外的路徑較長，而膀胱的內表面也比較大，尿液與粘膜的接觸面積和接觸時間大于唾液，所以尿液SIgA基準值高于唾液。但尿的生成量遠大于唾液的分泌量，導致尿液中對SIgA水平變化敏感度低于唾液，致使運動干預后尿SIgA變化幅度小于唾液SIgA，因而急性運動導致唾液SIgA變化的靈敏度高于尿液。

大強度運動會造成機體炎性因子IL-1、TNF-α上調，同時使抗炎性因子IFN-γ下調從而導致炎癥反應［9，11］和唾液皮質醇水平增加［12］，這可能是造成尿液SIgA增加的幅度隨運動強度增加下降和唾液SIgA水平與在HIE組回落的原因之一。表2顯示，單次低強度運動仍然對尿液SIgA變化產生了顯著影響，但低強度運動對唾液SIgA卻影響甚微。低強度運動對唾液和尿液SIgA造成不同影響的原因還不是很清楚。推測口腔接觸的抗原數量和種類遠大于輸尿管、膀胱和尿道，可能會導致輸尿管、膀胱和尿道的免疫敏感性高于口腔，使尿路粘膜免疫在運動導致的炎癥反應中應答比較敏感而明顯。運動加劇了物質和能量代謝，尿液中含有機體絕大部分的可溶性代謝廢物，而某些代謝物可能具有致炎作用，以及支配3大唾液腺的交感和副交感神經在運動中的興奮變化也會導致唾液SIgA和唾液皮質醇水平的波動［13］，可能是造成唾液和尿液SIgA對低強度運動有不同反應的原因之一。口腔與大氣環境相通，受高原低氧刺激也遠比輸尿管、膀胱和尿道更直接。本測試是在海拔1 700m左右亞高原地區進行，受試大學生均在當地居住時間大于1年，可以認為受試者對測試區高原環境產生了習服。即便這樣，低氧刺激仍可能對粘膜SIgA分泌產生影響［14］。低氧訓練可致使大鼠腸道SIgA分泌減少［15］，說明高原低氧環境對粘膜免疫可能具有負性調節作用，也可能是唾液SIgA在低強度運動干預下變化顯著低于尿液的原因。

測試結果顯示，無論低強度、中強度還是高強度急性運動，都沒有表現出明顯的粘膜免疫抑制作用。由于普通人群難以維持長時間的高強度運動，HIE組靶心率持續時間僅為5min，這可能是導致單次大強度運動下未出現明顯的粘膜免疫抑制現象的原因之一［16］。本研究未對其他免疫指標進行測試，因此評估粘膜免疫功能仍缺乏足夠證據。但可以肯定的是，單次急性運動可以顯著提高人體唾液和尿液SIgA水平，而低水平的唾液SIgA和URTI發生有密切關系［17］。

5 結論

單次中、高強度急性運動顯著增加受試者唾液SIgA水平；單次低、中、高強度急性運動顯著增加受試者尿液SIgA水平；急性運動可以對人體粘膜免疫機能造成顯著影響，且短時間低、中、高強度急性運動未發現顯著的粘膜免疫抑制現象。