益生菌發酵牦牛肉血腸的制作工藝優化

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

中國是世界上擁有牦牛數量最多的國家,約占世界牦牛總數的95%,存欄數約有一千三百多萬頭[1]。血液作為牦牛屠宰加工中的主要副產物,是十分理想的蛋白質資源。研究發現,牦牛全血、血漿和血細胞的蛋白質含量分別為15.5%±0.8%、6.9%±0.7%、32.7%±0.9%[2-3],但是長期以來這些血液大都作為廢棄物被排放掉,既造成環境污染,也是很大的浪費。目前,國內通常利用畜禽血液制作血豆腐、血丸子和血腸[4-5]等;西班牙北部Burgos周邊地區血腸則由洋蔥、大米、動物脂肪、血液混合而成[6];在日本,一些廠家用血紅素作為香腸著色劑,用血漿粉代替肉原料制作香腸[7],但都是未發酵產品。發酵香腸是指將絞碎的肉、發酵劑和其他輔料按適當比例混合后灌入腸衣,經微生物發酵制成的發酵肉制品,具有穩定的微生物特性和典型發酵香味[8]。發酵香腸的口味獨特、香味濃郁,在我國有很大市場潛力[9]。乳酸菌作為一種應用于發酵肉制品的主要益生菌[10],其產生的有機酸可以使鈣、磷、鐵的利用率提高,促進人體吸收[11]。制作發酵牦牛血腸,不僅可以有效利用牦牛血資源,還可以生產出一種高蛋白、低脂肪、易消化吸收又有其獨特風味的產品。李福存[12]對發酵鴨血腸工藝進行了研究,發現鴨血添加量為25%,菌種接種量為107cfu/g,在30 ℃發酵18 h后的血腸品質最佳。黎美蓮等[13]探討了不同鵝血添加量對鵝血香腸質構和感官特性的影響,發現鵝血的添加量為16%時,香腸的質構、色澤和口感較好。

目前,采用牦牛血制作發酵牦牛血腸尚未見報道。本研究采用牦牛血制作益生菌發酵牦牛血腸,旨在優化牦牛發酵血腸制作工藝參數,篩選出最適制作工藝,同時考察不同牦牛血添加量、發酵溫度、發酵時間以及菌種添加量對發酵牦牛血腸品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛血、牦牛肉(背最長肌) 紅原牦牛屠宰廠;豬腸衣、氯化鈉、三聚磷酸鈉、抗壞血酸、谷氨酸鈉、五香粉、葡萄糖 購于成都本地市場;植物乳桿菌 購于中國工業微生物菌種保藏管理中心;戊糖片球菌 購于四川省微生物資源平臺菌種保藏中心;MRS肉湯、MRS培養基 均為生物試劑,由杭州微生物試劑有限公司提供。

PL30型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;MP511型實驗室pH計 上海三信儀表廠;MDF-U4086S超低溫冰箱 三洋電器有限公司;DHG-9240A電熱恒溫鼓風恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;TA.TX Plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司;CR-400色彩色差儀 日本KONICA MINOLTA公司;JYL-C022E料理機 九陽股份有限公司;DHP-9052電熱恒溫培養 上海齊欣科學儀器有限公司;SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵劑制備 參考王愷等[14]的方法并稍作修改。分別將植物乳桿菌和戊糖片球菌按V(菌液)∶V(培養基)=1∶15的比例接種于MRS肉湯中,在37 ℃恒溫培養箱內培養24 h,重復上述操作兩次。培養基明顯渾濁時,表明活化完成,4 ℃冰箱備用。利用MRS瓊脂培養基對完成活化的菌種進行平板計數。

1.2.2 血腸制作

1.2.2.1 工藝流程

1.2.2.2 操作步驟 選擇牦牛肉背最長肌,修整除去筋膜、筋腱,清水清洗除去雜質和油膩后瀝干水分;牦牛血經雙層紗布過濾,除去雜物,備用;將原料肉切成長、寬、高均為 4～5 cm 的肉丁后放入料理機中通過5 mm孔徑篩板絞成均勻的肉餡;在肉餡中加入適量牦牛血及食鹽3.0%、三聚磷酸鈉0.3%、抗壞血酸0.03%、谷氨酸鈉0.05%、五香粉0.4%、葡萄糖1.0%,攪拌均勻;植物乳桿菌與戊糖片球菌以1∶1的比例(107cfu/g)分別接種于肉餡中;攪拌后的肉餡采用人工灌腸方式灌制在天然腸衣中,灌制過程中應注意肉餡分布均勻松緊適度,防止灌得過飽而脹破腸衣;灌裝好的腸體每隔10～20 cm用線繩結扎,用排氣針扎眼,排除空氣;溫水漂洗腸體去除表面污物和雜質,然后將處理好的血腸體置于恒溫培養箱中發酵;發酵完成后放入沸水水浴鍋中持續加熱10 min;擦干腸衣表面水分后自然冷卻至室溫;貯藏備用[15-16]。

1.2.3 單因素實驗 參考李福存[12]的實驗方法并修改,考察不同牦牛血添加量、發酵溫度、發酵時間以及菌種添加量對發酵牦牛血腸品質的影響。

1.2.3.1 牦牛血添加量對血腸品質的影響 牦牛血添加量分別為15%、20%、25%、30%、35%,菌種添加量為1%,以未添加牦牛血的灌腸為對照,于30 ℃發酵18 h,以pH、蒸煮損失率、感官、色差、質構為評價指標,確定最適牦牛血添加量,其中感官評價為首要考慮指標。

1.2.3.2 發酵溫度對血腸品質的影響 牦牛血添加量為20%,菌種添加量為1%,分別于20、25、30、35、40 ℃發酵18 h,以pH、蒸煮損失率、感官、色差、質構為評價指標確定最適發酵溫度,其中感官評價為首要考慮指標。

1.2.3.3 發酵時間對血腸品質的影響 牦牛血添加量為20%,菌種添加量為1%,于30 ℃分別發酵14、16、18、20、22 h,以pH、蒸煮損失率、感官、色差、質構為評價指標確定最適發酵時間,其中感官評價為首要考慮指標。

1.2.3.4 菌種添加量對血腸品質的影響 牦牛血添加量為20%,菌種添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,于30 ℃發酵16 h,以pH、蒸煮損失率、感官、色差、質構為評價指標為評價指標,確定最適菌種添加量,其中感官評價為首要考慮指標。

1.2.4 正交試驗設計 根據牦牛血添加量、發酵溫度、發酵時間以及菌種添加量的單因素試驗結果,經過數據分析篩選后,采用L9(34)表設計4因素3水平正交試驗,以pH、蒸煮損失率、感官評分為評價指標優化發酵牦牛血腸工藝條件,其中感官評分為主要評價指標。

1.2.5 理化指標測定

1.2.5.1 pH的測定 參考Yang等[17]和王德寶等[18]的方法并略作修改。稱取3 g切碎的血腸,加入27 mL蒸餾水混勻,靜置30 min后用pH計測定上清液pH。

1.2.5.2 蒸煮損失測定 根據Al-Bachira等[19]報道的方法,并進行改進。將樣品稱重(W1)后封口包裝,放入沸水水浴鍋中持續加熱10 min。樣品冷卻至室溫后,開封用濾紙輕輕擦干肉樣表面水分,稱重(W2)。

式中:W1:初始樣品質量;W2:煮制降溫后樣品質量。

1.2.5.3 色差的測定 將血腸切成高2.5 cm,半徑1.5 cm的圓柱體,用色差計測定血腸的L*值、a*值和b*值,每個樣品上隨機取三點進行測定[20]。

1.2.6 感官評分 感官評定前,邀請5位食品專業人員進行培訓,對發酵血腸外觀、組織形態、色澤、氣味四個方面進行感官評定,評分標準見表2[12]。

表2 發酵血腸感官評價標準Table 2 Standard for sensory evaluationof fermented blood sausage

1.2.7 質構的測定 采用質構儀測定發酵牦牛血腸的硬度、彈性、內聚性、咀嚼性和回復性[21]。將血腸切成高2.5 cm,半徑1.5 cm的圓柱體,采用TPA模式,探頭為P/0.5S球形探頭,測前下降速度1.0 mm/s、測試速度1.0 mm/s、測后上升速度1.0 mm/s,負載類型為Auto-5.0 g,數據采集速度為200 pp/s。

1.3 數據分析

所有樣本處理重復3次,使用SPSS V19.0分析數據,采用ANOVA進行方差分析和顯著性檢驗、Duncan法進行多重比較,顯著性水平為P<0.05,做圖表使用Excel 2010軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 牦牛血添加量對血腸品質的影響 由表3可知,發酵血腸的pH在4.40至4.48之間;蒸煮損失率隨著血添加量的增加呈先減少后增加的趨勢(P>0.05);當血添加量較少時,牦牛血與肉的粘結性不是很好,因此有較高的蒸煮損失率;當血添加量逐漸增加時,牦牛血與牦牛肉可以較好的結合,蒸煮損失率降低,此外,蛋白質含量增加可以提高血腸蒸煮過程的持水性[22],這可能也是血腸的蒸煮損失率降低的原因之一;當血添加量繼續增加時,由于血液中水分含量較多,可能會導致蒸煮損失率增加;感官評分則先增加后減少(P<0.05),血添加量為20%時發酵血腸的pH為4.41,蒸煮損失率為23.83%,感官評分為93.90分。

表3 血添加量對發酵血腸理化指標和感官品質的影響Table 3 Effects of blood addition on physicochemical propertiesand sensory quality of fermented blood sausage

由圖1可以看出,隨著血添加量的增加,L*值、a*值呈逐漸下降趨勢,b*值呈先下降后上升的趨勢。肌紅蛋白是肉的主要呈色物質,血紅蛋白則是牦牛血的主要呈色物質,二者與氧氣結合會產生鮮紅色,但受熱會變成灰褐色的高鐵蛋白,使血腸顏色變暗、紅色加深。這是因為肉和血中的Fe2+在高溫下被氧化成Fe3+,形成血腸特有的色澤,牦牛血量過多時,無法保持原先的色澤,使血腸的顏色過深[13]。添加牦牛血可以對血腸進行著色,賦予血腸獨特的紅色。牦牛血中含有豐富的蛋白質、糖、脂肪等有機物及無機鹽、微量元素等無機物,可增加血腸的營養物質含量[13]。牦牛血添加量為15%時,發酵血腸有最大的色差值,此時發酵血腸顏色最好。

圖1 血添加量對發酵血腸色差的影響Fig.1 Effect of blood addition on colorchanges of fermented blood sausage

根據表4可知,隨著血添加量的增加,發酵血腸的硬度和咀嚼性呈先下降后上升又下降的趨勢,彈性呈先增加后減少的趨勢,內聚性呈先上升后下降又上升的趨勢。硬度是指食品變形或穿透產品所需的力,是保持食品形狀的內部結合力;彈性表示在外力作用下發生形變后的物體在撤除外力后恢復原來狀態的能力;內聚性反映咀嚼食物時食物抵抗受損并緊密連接,使食物保持完整的性質[23-24]。有研究表明香腸的硬度和咀嚼性與蛋白變性有關[25],血腸煮制后蛋白變性,牦牛血添加量不同導致血腸中蛋白質含量不同,煮制后蛋白變性程度也不同,從而影響血腸的硬度和咀嚼性。血添加量為15%時,發酵血腸的硬度和咀嚼性最高(P<0.05),此時產品口感過硬,感官評分較低;血添加量為20%時,發酵血腸的硬度為1920.11 g,彈性為0.66,內聚性為0.62,咀嚼性為782.41 g,回復性為0.08,此時,發酵血腸有較高的硬度和咀嚼性,彈性和內聚性較好,且感官評分最高,口感細膩。

表4 血添加量對發酵血腸質構的影響Table 4 Effect of blood addition on texture of fermented blood sausage

綜上所述,當牦牛血添加量為15%時,發酵牦牛血腸的色澤和質構最好,但蒸煮損失率較大,感官評分低;牦牛血添加量為20%時,有較合適的pH、較低的蒸煮損失率和較好的色澤,且發酵血腸外形美觀,具有獨特的風味,肉質細膩且彈性足,咀嚼良好,切面平整,肉質緊密。香氣濃郁,無血腥氣味,因此選擇牦牛血添加量為20%。

2.1.2 發酵溫度對血腸品質的影響 從表5可以看出,當發酵溫度在20～25 ℃時,益生菌活性受到抑制,產酸較慢,發酵后pH較高。發酵溫度在30～35 ℃時,益生菌的活性較穩定,pH差異不顯著(P>0.05)。當溫度為40 ℃時,益生菌活性進一步提高,產酸能力加強,pH顯著下降(P<0.05)。隨著發酵溫度的增加,感官評分呈先上升后下降的趨勢。當發酵溫度為30 ℃時,發酵血腸的感官評分最高,為86.00分。而此時發酵血腸的蒸煮損失率最低,為14.92%。

表5 發酵溫度對血腸理化指標和感官品質的影響Table 5 Effects of fermentation temperature onphysicochemical properties and sensory quality of blood sausage

色澤是評價發酵香腸品質的重要指標之一,色澤的變化與肉中肌紅蛋白及血中血紅蛋白被氧化成高鐵肌紅蛋白有關,此外,還與脂肪氧化、氧化還原酶系、氧化還原電位、氧分壓等因素有關[24]。由圖2可知,隨著發酵溫度的增加,L*值呈波動性上升趨勢,a*值和b*值則呈先增加后減少再增加的趨勢。當發酵溫度達到40 ℃時,L*值、a*值和b*值都顯著增加,這可能是因為發酵溫度過高,使血腸pH下降,NO2-迅速分解為NO-,NO-與肌紅蛋白和血紅蛋白分別結合生成亞硝基肌紅蛋白和亞硝基血紅蛋白,a*值迅速上升[26]。發酵溫度為40 ℃時,發酵血腸有較好的色澤,L*值、a*值和b*值分別為23.84,10.70,6.20。

圖2 發酵溫度對血腸色差的影響Fig.2 Effect of fermentation temperatureon color changes of blood sausage

牦牛血腸的質構變化見表6。發酵血腸的硬度、彈性、內聚性和咀嚼性隨發酵溫度的增加有上升的趨勢(P<0.05),而回復性不受溫度的影響(P>0.05),這可能是因為發酵溫度越高,pH下降速度越快,促進蛋白質的凝膠作用。研究發現,蛋白質的變性和凝固降低了血腸的持水力,導致水分損失,同時伴隨產品質量減輕和直徑減小,從而使血腸的結構更加致密[24]。發酵溫度在20～25 ℃時,發酵血腸的硬度和咀嚼性較低(P>0.05),發酵溫度在30～35 ℃時,發酵血腸的質構無顯著性差異(P>0.05),有較好的彈性、內聚性、咀嚼性和回復性。發酵溫度為40 ℃時,發酵血腸的硬度、彈性和咀嚼性最高,此時產品口感過硬,感官評分最低。

表6 發酵溫度對血腸質構的影響Table 6 Effect of fermentation temperature on texture of blood sausage

綜上述,發酵溫度在40 ℃時,發酵血腸有較好的色差值,但其pH、蒸煮損失率和感官評分較差,結合感官評分、色差和質構考慮,確定發酵溫度在30 ℃時最佳。

2.1.3 發酵時間對血腸品質的影響 如表7所示,隨著發酵時間的延長,發酵血腸的pH呈先減少后增加的趨勢,蒸煮損失率和感官評分則呈先增加后減少的趨勢。當發酵時間為16 h時,發酵血腸的pH為4.92,蒸煮損失率為7.44%,此時的感官評分最高為88.33分。當發酵時間達到22 h時,pH又顯著上升(P<0.05),可能是因為此時水分含量下降,體系鹽濃度增大,抑制了益生菌的生長繁殖;蛋白質降解產生生物胺[27]以及酶對蛋白質的作用對此結果也有影響[28]。

表7 發酵時間對血腸理化指標和感官品質的影響Table 7 Effects of fermentation time on physicochemicalproperties and sensory quality of blood sausage

發酵香腸主要色素為褐色的球蛋白血色素原,亦有亞硝基高鐵血色素原[29]。從圖3可以看出,a*值和b*值隨著發酵時間的延長呈先上升后下降最后升高的趨勢,且在發酵20 h時達到最低,發酵至22 h后,發酵血腸的a*值和b*值均顯著增加,而L*值則無顯著變化,但此時血腸發酵時間過長,感官評分較低,口感粗糙,略有異味。在發酵初期,血腸中水分含量較高,NaNO2會轉變為NO,NO可與肌紅蛋白和血紅蛋白結合為鮮紅色的一氧化氮肌紅蛋白和一氧化氮血紅蛋白,發酵血腸的a*值升高;隨著發酵時間的延續,血腸中水分含量降低,血液內部色素物質濃縮,使血腸顏色逐漸加深,血腸的a*值隨之下降[30-31],發酵時間為16 h時,L*值為23.04,a*值為6.43,b*值為2.71。

圖3 發酵時間對血腸色差的影響Fig.3 Effect of fermentation timeon the color changes of blood sausage

根據表8可知,隨著發酵時間的延長,發酵血腸的硬度呈先增加后減少又增加的趨勢,彈性、內聚性和咀嚼性則呈增加趨勢,發酵16～18 h時,發酵血腸質構指標差異不顯著(P>0.05),發酵16 h的發酵血腸硬度和回復性大于發酵18 h的發酵血腸。發酵20～22 h時,發酵血腸質構指標無顯著性差異(P>0.05),硬度顯著高于發酵16～18 h的發酵血腸(P<0.05),22 h時的咀嚼性顯著高于發酵16～18 h的發酵血腸(P<0.05),發酵22 h后,發酵血腸的硬度和咀嚼性最高,分別為2129.65和1198.02 g。

表8 發酵時間對血腸質構的影響Table 8 Effect of fermentation time on texture of blood sausage

發酵時間為22 h時,發酵血腸的色差值、硬度及咀嚼性較好,但感官評分最低,發酵時間為20 h時,發酵血腸的質構較好,但色差值和感官評分較低,發酵血腸發酵18 h后的pH和蒸煮損失率低于發酵16 h的發酵血腸,但發酵16 h的感官評分,色差值,硬度和回復性較好,綜合以上指標,選擇最佳發酵時間為16 h。

2.1.4 接種量對血腸品質的影響 由表9可以看出,隨著接種量的增加,發酵血腸的pH先下降后上升又下降的趨勢,感官評分則呈下降趨勢。低的pH能有效抑制微生物的生長繁殖,且促進蛋白質降解為氨基酸和小分子肽,促進脂肪分解為游離脂肪酸和甘油酯,這些分解物均是形成血腸風味的重要前體物,有助于形成發酵血腸特有的風味[26,30]。當接種量增加至1.0%時,此時發酵血腸的pH為4.74,能有效控制病原微生物和腐敗微生物的生長繁殖[32],且血腸的感官評分也相對較高,感官評分為82.20分,而其蒸煮損失率為5.32%。當接種量為2.0%時,pH有所上升,可能是因為接種量過高,菌種間會競爭性利用糖原,導致產酸速度緩慢。

表9 接種量對血腸理化指標和感官品質的影響Table 9 Effects of inoculation amount on physicochemicalproperties and sensory quality of blood sausage

根據圖4可知,隨著接種量的增加,L*值呈上升趨勢,a*值則先增加后減少,接種量為2.0%時,a*值和b*值最大,分別為10.79和4.17,接種量在1.0%時b*值最小為2.73。

圖4 接種量對血腸色差的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on color changes of blood sausage

從表10中可以看出,發酵血腸的硬度、彈性、內聚性、咀嚼性和回復性都隨接種量的增加呈先上升后下降又上升的趨勢,這可能是因為益生菌的發酵作用使血腸pH降低,降到蛋白質等電點后,促進蛋白質凝膠化使發酵血腸的硬度、內聚性和咀嚼性增加[33],但當接種量過高時,可能會導致益生菌產生競爭性抑制,無法產生較好的發酵效果,繼而影響發酵血腸的質構。接種量在1.0%～1.5%時,硬度、彈性、內聚性、咀嚼性和回復性差異不顯著(P>0.05),接種量為1.5%時發酵血腸有較好的質構,此時,硬度為2219.01 g,彈性為0.84,內聚性為0.69,咀嚼性為1291.35 g,回復性為0.27。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表10 接種量對血腸質構的影響Table 10 Effect of inoculation amount on texture of blood sausage

表10 L9(34)正交試驗pH、感官評價、蒸煮損失率結果Table 10 L9(34)orthogonal test results of pH value、sensory quality and cooking loss rate

接種量為1.0%時,pH適中,b*值最小,蒸煮損失率及感官評分在接種量為0.5%時最佳,與接種量為1.0%的發酵血腸差異不顯著(P>0.05),接種量為1.5%時,發酵血腸質構最好,與接種量為1.0%時發酵血腸質構指標差異不顯著(P>0.05),綜合考慮以上指標,選擇1.0%為最佳接種量。

2.2 正交試驗

由表11極差分析可知,各因素對發酵血腸pH的影響順序為發酵溫度>發酵時間>接種量>血添加量,各因素對發酵血腸感官評價的影響順序為接種量>血添加量>發酵溫度>發酵時間,對蒸煮損失率的影響順序為血添加量>接種量>發酵時間>發酵溫度,其中pH在A2B3C2D3時較為合適,我國消費者對pH過低的發酵血腸接受程度有限,因此,血腸的pH不易過低;蒸煮損失率在工藝參數為在A1B1C3D2時最低;感官評分在發酵牦牛血腸工藝參數為A2B1C2D3時最高,感官評價是對血腸的總體評鑒,感官評價越高,說明發酵血腸的可接受度越高,感官評價為首要考慮指標,包括外觀、組織形態、色澤和氣味,反映發酵血腸品質,pH影響產品口感,蒸煮損失率表征成品率,綜合考慮確定生產發酵牦牛血腸的工藝參數為A2B1C2D3,即感官評分最高組,最適發酵條件為牦牛血添加量20%,發酵溫度25 ℃,發酵時間16 h,菌種添加量1.5%,此時，發酵牦牛血腸的pH為5.10，蒸煮損失率為6.76%，感官評分為89.87分，發酵牦牛血腸外形美觀,切面整齊,口感細膩,咀嚼良好,無血腥氣味。

3 結論

本文通過單因素和正交試驗設計,優化發酵牦牛肉血腸生產過程中牦牛血添加量、發酵溫度、發酵時間和菌種添加量,并探討其對發酵牦牛血腸的品質影響。

血添加量對發酵牦牛血腸的pH、感官品質、色差值、質構均影響較大,綜合評定20%添加量最適;發酵溫度在40 ℃時,發酵血腸有較好的色差值,但其pH、蒸煮損失率和感官評分較差,結合感官評分、色差和質構考慮,確定發酵溫度在30 ℃時最適;發酵時間為22 h時,發酵血腸的色差值和質構較好,但感官評分最低,發酵16 h的感官評分,色差值,硬度和回復性較好,選擇發酵16 h 為最適發酵時間;接種量為1.0%時,發酵血腸的pH適中,b*值最小,蒸煮損失率及感官評分與接種量為0.5%的發酵血腸差異不顯著(P>0.05),綜合評定選擇1.0%為最適接種量。結合單因素實驗結果利用正交試驗進一步分析,制作發酵牦牛血腸的最優組合為牦牛血添加量20%,發酵溫度25 ℃,發酵時間16 h,菌種添加量1.5%,此時,發酵牦牛血腸的pH為5.10,蒸煮損失率為6.76%,感官評分為89.87分,腸體堅實有彈性、切面平整、質地口感適中、色澤良好、香味濃郁純正,無血腥氣味,綜合品質較好良好。