艾拉莫德對類風濕關節炎滑膜細胞凋亡及炎癥因子水平的影響

穆培霞，馬 玲，付冬冬，楊學華，呂書龍，吳 潔，范文強

1)新鄉市中心醫院特需二科 河南新鄉453000 2)新鄉市中心醫院風濕免疫科 河南新鄉 453000 3)新鄉市第二人民醫院腎病風濕科 河南新鄉 453000 4)新鄉市中醫院風濕科 河南新鄉453000

類風濕關節炎主要以侵蝕性、慢性關節炎為主要表現，是一種自身免疫性疾病。滑膜組織異常是類風濕關節炎發生的關鍵，其中滑膜細胞凋亡障礙和炎癥因子分泌是類風濕關節炎發生的主要原因[1]。艾拉莫德是一種抗風濕新藥，具有抗炎、抑制免疫球蛋白產生等作用[2]。有報道[3]顯示，艾拉莫德可改善類風濕關節炎關節疼痛，并且對于類風濕關節炎滑膜細胞增殖和免疫功能具有調節作用。該研究觀察了艾拉莫德對類風濕關節炎滑膜細胞凋亡和炎癥因子分泌的作用，探討艾拉莫德治療類風濕關節炎的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料收集2018年1至8月新鄉市中心醫院膝關節置換手術切除的類風濕關節滑膜組織，標本采集經患者及家屬知情同意。艾拉莫德購自海南先聲藥業有限公司，胞質蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒購自美國Sigma公司，活化的Caspase-3(C-Caspase-3)抗體、Bcl-XL抗體、NF-κBp65抗體購自美國Abcam公司，細胞色素C抗體購自碧云天生物技術有限公司，IL-1β含量檢測試劑盒、TNF-α含量檢測試劑盒均購自上海康朗生物科技有限公司。

1.2類風濕關節炎滑膜細胞的分離培養參照文獻[4]，滑膜組織以PBS洗滌后剪成約1 mm3的碎塊，添加0.8 g/L Ⅱ型膠原酶，37 ℃孵育4 h。1 000×g離心10 min，吸棄上清，添加2.5 g/L胰蛋白酶，37 ℃孵育0.5 h。以120目的濾網過濾，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM細胞培養液懸浮細胞，置37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養。取第3代滑膜細胞用于后續實驗。

1.3細胞分組處理滑膜細胞分別用含艾拉莫德終質量濃度為0、600、1 200、1 800 μg/L[5]的培養液培養48 h。

1.4Annexin-V FITC/PI雙染法測定細胞凋亡取4組細胞，調整細胞密度為1×106個/mL。移液槍吸取1 mL細胞懸液，以200 μL結合緩沖液懸浮細胞，添加PI和 Annexin-V FITC染液5 μL，避光、室溫下靜置20 min，加300 μL緩沖液，上流式細胞儀檢測，計算凋亡率。實驗重復3次。

1.5ELISA法測定細胞培養液中IL-1β、TNF-α含量取4組細胞的培養液，采用ELISA法測定IL-1β、TNF-α含量，按照試劑盒說明操作。實驗重復3次。

1.6Western blot法測定細胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65以及胞質和線粒體中細胞色素C蛋白的表達取4組細胞，分別提取細胞總蛋白、胞質蛋白和線粒體蛋白。取總蛋白與上樣緩沖液混勻后，100 ℃反應5 min。按照每孔40 μg蛋白樣品上樣，設置80 V電壓電泳約30 min，調整電壓到120 V，觀察溴酚藍進入到凝膠底部，終止電泳。取出蛋白凝膠，轉膜，然后將NC膜放在50 g/L牛血清白蛋白溶液中孵育2 h，依次加一抗(C-Caspase-3、Bcl-XL和NF-κBp65抗體，稀釋比例分別為1∶400、1∶600、1∶400)、二抗(稀釋比例為1∶2 000)充分孵育。ECL顯色后，用Image J掃描條帶灰度值，分析蛋白表達變化。同上方法檢測胞質和線粒體中細胞色素C蛋白的表達(一抗稀釋比例為1∶800)。細胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65以及胞質中細胞色素C蛋白的表達以GAPDH為內參，線粒體中細胞色素C蛋白的表達以Porin為內參。目的蛋白表達水平為目的條帶與內參條帶灰度值的比值。實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0處理數據。4組間以上各指標的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組細胞凋亡率和培養液中IL-1β、TNF-α含量的比較不同劑量艾拉莫德處理后，滑膜細胞凋亡率升高，細胞培養液中IL-1β、TNF-α含量降低(表1)。

表1 4組細胞凋亡率及培養液中IL-1β、TNF-α含量的比較(n=3)

*：與0 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05；#：與600 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05；△：與1 200 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05

2.2各組細胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65及胞質和線粒體中細胞色素C蛋白表達水平的比較見圖1～3和表2。

1～4:分別為0、600、1 200、1 800 μg/L艾拉莫德組

1～4:分別為0、600、1 200、1 800 μg/L艾拉莫德組

不同劑量艾拉莫德處理后，C-Caspase-3蛋白水平升高，Bcl-XL和NF-κBp65蛋白表達水平下降，滑膜細胞胞質中細胞色素C蛋白表達水平升高，線粒體中細胞色素C蛋白表達水平下降。

表2 各組細胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65及胞質和線粒體中細胞色素C蛋白表達水平的比較(n=3)

*：與0 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05；#：與600 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05；△：與1 200 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05

3 討論

類風濕關節炎是一種慢性自身免疫性疾病，能夠侵襲并破壞局部關節組織，具有高致殘率[5]。研究[6]顯示，滑膜細胞功能異常改變是類風濕關節炎發生的重要原因，滑膜細胞能夠釋放多種炎癥因子進入血液以及滑液中，這些細胞因子能夠進一步刺激周圍炎性細胞以及關節軟骨細胞等釋放更多的損傷因子而破壞關節軟骨；另外，滑膜細胞凋亡障礙也是類風濕關節炎發生的關鍵。

艾拉莫德是一種具有抗炎以及免疫調節作用的小分子藥物，屬于對氧萘酮衍生物[7]。研究[8]顯示，艾拉莫德具有顯著的抗關節破壞功效，能夠減輕組織炎癥反應，可改善類風濕關節炎患者滑膜損傷[9]。本研究結果表明，艾拉莫德可誘導類風濕關節炎滑膜細胞凋亡，同時抑制炎癥因子的分泌。

研究[10-11]顯示，細胞凋亡的發生與細胞內多種調控途徑有關。線粒體凋亡途徑是細胞發生凋亡的主要途徑之一，其關鍵是線粒體中的細胞色素C釋放入胞質，誘導下游凋亡蛋白的表達，從而誘導細胞凋亡。Caspase和Bcl-2蛋白家族是目前發現的與細胞凋亡關系最為密切的調控因子[12]。Caspase-3是位于細胞凋亡反應下游的凋亡執行因子，在細胞凋亡過程中發揮不可逆的誘導作用[13]。Bcl-XL是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白[14]。本研究結果顯示，艾拉莫德處理后的類風濕關節炎滑膜細胞中線粒體細胞色素C蛋白表達水平降低，胞質細胞色素C蛋白表達水平升高，C-Caspase-3蛋白表達水平升高，Bcl-XL蛋白表達水平下降，說明艾拉莫德可能通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。

NF-κB是一個多功能調節因子，對于細胞凋亡和炎癥反應均有重要作用，其可以激活細胞中炎癥因子表達，同時可以通過多種途徑調控細胞凋亡發生[15-16]。研究[17]表明，Bcl-XL有NF-κB的結合位點，NF-κB激活可以引起Bcl-XL表達水平升高，從而抑制細胞凋亡。NF-κB激活可以抑制線粒體細胞色素C釋放，從而抑制Caspase凋亡反應的發生[18]。NF-κB還可以直接誘導細胞中炎癥因子如IL-1β、TNF-α的釋放從而促進炎癥反應的發生[19]。NF-κBp65是NF-κB功能發揮的關鍵亞單位，也是NF-κB信號通路激活的標志[20]。本研究結果顯示，艾拉莫德可以減少類風濕關節炎滑膜細胞中NF-κBp65的表達，說明艾拉莫德可能通過抑制NF-κB激活調控線粒體凋亡途徑，從而誘導類風濕關節炎滑膜細胞凋亡，減少細胞炎癥因子釋放。

目前對于艾拉莫德在類風濕關節炎滑膜細胞凋亡和炎癥因子釋放中的具體調控機制還不明確，在以后的實驗中會繼續探討。