細菌脂磷壁酸在小鼠乳房假體植入術(shù)后包膜攣縮形成中的作用

Ikram Ahmad(唐英俊)， 宣天梵， 陶夢圓， 張思敏， 欒文杰， 亓發(fā)芝

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院整形外科，上海 200032

包膜攣縮是乳房假體植入術(shù)后最常見的并發(fā)癥，復(fù)發(fā)率高。過量的肌成纖維細胞激活和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積導(dǎo)致植入物周圍包膜增厚、變硬和收縮[1-4]。包膜攣縮是乳房假體植入術(shù)后再次手術(shù)的主要原因，迄今為止還沒有有效的預(yù)防方法。包膜攣縮的病因尚不清楚。研究表明，細菌感染，尤其表皮葡萄球菌感染，與包膜攣縮的發(fā)病具有相關(guān)性[5-10]。

表皮葡萄球菌是一種條件性致病菌，一般粘附于人體的皮膚和黏膜，在生理條件下，表皮葡萄球菌對人體無害，而免疫功能低下的患者感染風(fēng)險會增加。由于其具有形成細菌生物膜的能力，表皮葡萄球菌可作為病原體在宿主體內(nèi)存活，生物膜保護細菌免受機體免疫系統(tǒng)和抗生素的清除[11-14]。本研究建立硅膠植入物周圍注射細菌脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)小鼠模型，采用H-E染色、Masson染色和酶標(biāo)免疫組織化學(xué)染色觀察植入物周圍組織結(jié)構(gòu)、纖維囊厚度和纖維化反應(yīng)程度；采用CD31染色計數(shù)新生血管數(shù)量；采用定量PCR檢測炎癥因子mRNA水平；采用Ki-67/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)染色計數(shù)增殖/凋亡細胞，旨在明確細菌感染對乳房假體植入術(shù)后包膜攣縮形成的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠，成年，雄性，共12只。設(shè)植入物周圍注射細菌LTA組，以植入物周圍注射生理鹽水為對照組，隨機分組，每組6只。動物實驗經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實驗倫理委員會審批(2016-123)。

1.2 硅膠植入物周圍注射細菌LTA模型 成年雄性C57BL/6小鼠，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。無菌條件下在小鼠背部皮下置入0.2 cm×0.2 cm硅膠植入物，絲線縫合。在植入物周圍皮下注射細菌LTA(10 μg/mL，每個植入物周圍20 μL)。LTA第1次注射2 h后用于定量PCR檢測。LTA注射每次間隔48 h，注射6次后用于H-E染色、Masson染色和酶標(biāo)免疫組織化學(xué)染色。

1.3 Masson染色 石蠟切片脫蠟至蒸餾水。蘇木素染5～10 min。鹽酸酒精混合液分化。流動水藍化，蒸餾水洗。麗春紅酸性品紅液中染5～8 min。蒸餾水洗。1%磷鉬酸中染1～3 min。不用水洗，直接入苯胺藍液或亮綠液 5 min。水速洗，置60℃溫箱中烘干，二甲苯透明，封片固定。

1.4 酶標(biāo)免疫組織化學(xué)染色 選取染色效果好與H-E染色同批次白片，烤片20 min。3%過氧化氫37℃，靜置10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶。抗原微波修復(fù)，室溫冷卻。封閉。室溫一抗孵育，45 min。二抗-酶標(biāo)聚物37℃放置30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 定量PCR 采用定量PCR分析移植物周圍LTA注射組和生理鹽水注射組炎癥因子相關(guān)基因的表達。按照TRIzol(Thermo Fisher Scientific，美國)操作步驟提取植入物周圍組織總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent kit試劑盒(Takara，日本)，逆轉(zhuǎn)錄后，用TB GreenTMPremix ExTaqTM試劑盒(Takara，日本)行定量PCR檢測。設(shè)計白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)特異性引物，由Invitrogen公司合成，引物序列詳見表1。95℃孵育5 min預(yù)變性，95℃孵育10 s變性，60℃ 30 s退火/延伸，共40個循環(huán)。以各目的基因與Gapdh表達比值為其相對表達量。各樣品重復(fù)測量3次。

表1 炎癥因子目的基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 細菌LTA對植入物周圍纖維化反應(yīng)的作用 采用硅膠植入物周圍注射細菌LTA模型， Masson染色結(jié)果顯示：生理鹽水注射組的植入物周圍形成一層薄的藍色纖維囊；與生理鹽水注射組比較，細菌LTA注射組的植入物周圍纖維囊厚度增加了(1.3±0.08)倍(P<0.05)，呈藍色和紅色(變性纖維結(jié)締組織)，見圖1。結(jié)果顯示：與生理鹽水組注射比較，細菌LTA注射組α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)面積增加了(12.38±0.91)倍(P<0.05)，見圖2。

圖1 植入物周圍注射細菌LTA對纖維囊厚度的作用

A：生理鹽水組；B：LTA組；C：注射細菌LTA增加植入物周圍纖維囊厚度.*P<0.01與對照組相比

圖2 植入物周圍注射細菌LTA對纖維化反應(yīng)的作用

A：生理鹽水組；B：LTA組；C：注射細菌LTA增加植入物周圍α-SMA面積.*P<0.01與生理鹽水組相比

2.2 細菌LTA對植入物周圍新生血管數(shù)量和炎癥反應(yīng)的作用 采用CD31染色標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞，研究細菌LTA對植入物周圍新生血管數(shù)量的作用。結(jié)果(圖3)顯示，生理鹽水注射組植入物周圍新生血管數(shù)量為每視野(29±2.65)根，細菌LTA注射組植入物周圍新生血管數(shù)量為(64±4.85)根，注射細菌LTA增加植入物周圍新生血管數(shù)量(P<0.05)。

圖3 植入物周圍注射細菌LTA對新生血管數(shù)量的作用

A：生理鹽水組；B：LTA組；C：注射細菌LTA增加植入物周圍新生血管數(shù)量.*P<0.01與生理鹽水組相比

采用定量PCR檢測植入物周圍炎癥因子，結(jié)果(圖4)顯示：與生理鹽水組比較，細菌LTA注射組增加植入物周圍IL-6 (P<0.05)和TNF-α mRNA水平(P<0.05)，不改變IFN-γ mRNA水平。

細菌LTA的受體是TLR2，采用定量PCR檢測植入物周圍TLR2 mRNA水平。與生理鹽水組比較，細菌LTA注射組提高植入物周圍TLR2 mRNA水平(P<0.05)。

圖4 植入物周圍注射細菌LTA對炎癥反應(yīng)的作用

2.3 細菌LTA對植入物周圍細胞增殖、凋亡的作用 分別采用免疫組織化學(xué)方法，以Ki-67和Caspase-3染色標(biāo)記植入物周圍增殖細胞和凋亡細胞。結(jié)果顯示：生理鹽水組注射組植入物周圍Ki-67陽性細胞數(shù)為(48±3.67)個，細菌LTA注射組為(115±8.72)個，注射細菌LTA增加植入物周圍增殖細胞數(shù)量(P<0.05)，見圖5。生理鹽水組注射組植入物周圍Caspase-3陽性細胞數(shù)為(38±2.65)個，細菌LTA注射組為(144±9.85)個，注射細菌LTA增加植入物周圍凋亡細胞數(shù)量(P<0.05)，見圖6。

圖5 植入物周圍注射細菌LTA對增殖細胞的作用

A：生理鹽水組；B：LTA組；C：注射細菌LTA增加植入物周圍Ki-67陽性細胞數(shù)量.*P<0.01與生理鹽水組相比

圖6 植入物周圍注射細菌LTA對凋亡細胞的作用

A：生理鹽水組；B：LTA組；C：注射細菌LTA增加植入物周圍Caspase-3陽性細胞數(shù)量.*P<0.01與生理鹽水組相比

3 討 論

細菌感染與乳房假體植入術(shù)后包膜攣縮具有相關(guān)性。細菌感染在包膜攣縮發(fā)病過程中的作用有待證實。本研究表明，多次注射細菌LTA增加植入物周圍纖維囊厚度和纖維化反應(yīng)，增加新生血管數(shù)量，增加IL-6、TNF-α、IFN-γ和TLR2 mRNA水平，增加增殖和凋亡細胞數(shù)量。

表皮葡萄球菌是條件致病菌，在生理條件下對人體無害；免疫功能低下的患者感染風(fēng)險增加。由于其形成細菌生物膜的能力，表皮葡萄球菌可以作為病原體在宿主體內(nèi)存活。LTA是革蘭陽性菌(如表皮葡萄球菌)細胞壁的組分，是核糖醇或甘油殘基由磷酸二鍵連接而成的多聚物。LTA的抗原性很強，是細菌的重要表面抗原。某些細菌的LTA能粘附在人類細胞表面，與致病性有關(guān)[15-17]。本研究結(jié)果顯示，多次局部注射細菌LTA能夠增加植入物周圍纖維囊厚度、纖維化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等，提示LTA是細菌感染誘發(fā)乳房假體植入術(shù)后包膜攣縮的充分條件，對提出預(yù)防包膜攣縮新策略具有重要意義。

已有文獻[18-24]報道，炎癥因子IL-6調(diào)控白細胞浸潤參與宿主對細菌的急性防御反應(yīng)；IL-6-/-轉(zhuǎn)基因小鼠無法有效清除細菌感染；相反，在慢性疾病炎癥模型中，IL-6是慢性炎癥和纖維化的驅(qū)動因子。本研究結(jié)果顯示，移植物周圍局部注射LTA增加IL-6 mRNA水平，提示細菌LTA誘發(fā)的包膜攣縮與炎癥因子IL-6具有相關(guān)性。

機體對病原微生物有固有性免疫和適應(yīng)性免疫2種應(yīng)答方式。病原微生物感染與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，免疫力完全正常的宿主，固有性免疫足以將病原微生物清除；當(dāng)感染趨向于慢性，或者宿主曾被致敏，則適應(yīng)性免疫應(yīng)答迅速啟動[25-27]。本研究結(jié)果顯示，多次局部注射細菌LTA增加植入物周圍纖維囊厚度，提示多次細菌感染或者細菌感染誘發(fā)的慢性炎癥過程與包膜攣縮的發(fā)生有關(guān)。

纖維囊是由成纖維細胞分裂、增殖、遷移，產(chǎn)生ECM形成的纖維結(jié)締組織。纖維化的過程包括：網(wǎng)狀纖維膠原化，膠原纖維變粗；成纖維細胞減少，炎細胞先后消失；新生血管退化，留下很少的小動脈及小靜脈，質(zhì)地堅韌，具有收縮性。本研究顯示，在纖維囊形成的過程中，LTA局部注射組，增殖細胞和凋亡細胞數(shù)量都增加；新生血管數(shù)量增加，提示實驗中LTA注射6次后取材，仍處于纖維囊形成、增厚的過程。

綜上所述，多次局部注射細菌LTA會增加植入物周圍纖維囊厚度，局部、反復(fù)或慢性細菌感染是乳房假體植入術(shù)后致包膜攣縮發(fā)病的充分條件，細菌LTA是促進纖維化反應(yīng)的致病物質(zhì)。