重組高遷移率組蛋白N2蛋白入胞與細胞定位研究

馬 驍， 徐恩杰， 尹 佳， 周許輝

海軍軍醫大學附屬長征醫院脊柱四科，上海 200003

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，特點為易早期轉移。15%～25%的患者在確診骨肉瘤時可檢測到肺部轉移[3]。骨肉瘤的主要治療方法為腫瘤切除術和非特異性聯合化療[4-5]。隨著腫瘤治療技術的發展，骨肉瘤患者的長期生存率有所提高[6]，但合并遠處轉移患者的生存率仍很低[7-9]。因此，抑制其轉移仍是抗腫瘤治療的關鍵。

高遷移率組蛋白N2(high mobility group chromosal protein N2,HMGN2)的異常表達與多種腫瘤的發生、發展相關[10-14]。研究[15-16]發現，HMGN2能抑制膀胱癌細胞和口腔鱗狀細胞癌細胞的生長，并促進其凋亡。本課題組以往研究[17]也表明，在骨肉瘤細胞中以慢病毒感染的方式過表達HMGN2會抑制細胞的轉移，提示HMGN2是一類抗腫瘤轉移因子，促進其在腫瘤細胞內的表達可作為一種治療骨肉瘤的臨床策略。但是，慢病毒過表達方法有潛在危險性。

有研究[18-20]表明，人外周血單核細胞和淋巴細胞可在受到外界刺激后向胞外分泌HMGN2。這種分泌的HMGN2可能也具有抑制骨肉瘤轉移的功能，而能否自行入胞是其發揮功能的基礎，目前鮮見相關研究。因此，本研究探討了外源性HMGN2蛋白能否進入骨肉瘤細胞及其細胞定位，期望能為未來研發類HMGN2結構藥物或刺激HMGN2釋放的藥物提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究材料 U-2OS骨肉瘤細胞和HEK-293FT細胞購自上海中國科學院科院細胞庫。慢病毒載體以及病毒包裝質粒購自吉凱基因。PVDF膜購自Millipore公司，牛血清白蛋白、FLAG M純化試劑盒、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自Sigma-Aldrich公司，一抗及ELISA試劑盒購自Abcam公司，二抗購自CST公司，ECL曝光液購自Pierce公司，DMEM購自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，TRIzol試劑、Lipofactamine 2000、雙抗(青霉素、鏈霉素)均購自Invitrogen公司，PrimeSTAR HS DNA聚合酶、SYBR Green預混液購自Takara公司，反轉錄試劑盒購自Applied Biosystems公司，NE-PER核蛋白提取試劑盒購自Thermo Fisher公司。

1.2 細胞培養 將U-2OS骨肉瘤細胞和HEK-293 FT細胞置入含10% 胎牛血清、青霉素 (100 U/L) 和 鏈霉素(100 mg/L)的DMEM培養基中，于含5%CO2的37℃細胞培養箱中培養。

1.3 HMGN2 過表達慢病毒載體構建與包裝 過表達慢病毒載體元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，以BamHI和AgeI內切酶進行酶切后，切膠回收。用TRIzol提取U-2OS細胞的總RNA，使用反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA，并以獲得的cDNA為模板擴增HMGN2片段。擴增引物序列正向：5′-AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC GCC ACC ATG CCC AAG AGA AAG GCT GAA G-3′，反向：5′-TCC TTG TAG TCC ATA CCC TTG GCA TCT CCA GCA CCT TC-3′。PCR擴增反應體系包括PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL、模板1 μL、上游擴增引物1 μL、下游擴增引物1 μL、dNTP Mix 4 μL、5×PS Buffer 10 μL、無酶水32.5 μL。PCR反應條件：98℃預變性5 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸60 s，共30個循環。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳并切膠回收。

將PCR產物交換入酶切后的GV492載體并進行轉化。將菌落PCR結果為陽性的菌落接種于LB培養基。菌落PCR引物序列正向：5′-GGG TCA ATA TGT AAT TTT CAG TG-3′，反向：5′- CCT TAT AGT CCT TAT CAT CGT C -3′。將菌液于37℃培養12 h后取適量進行測序。用DNA序列無誤的菌液抽提質粒。過表達組：將過表達質粒與包裝質粒共轉染至HEK-293FT細胞；空白組：將空載體和包裝質粒共轉染至HEK-293FT細胞。轉染后將細胞繼續培養48 h后，收取培養基上清，0.45 μm濾器過濾，以30 000 r/min 4℃離心3 h。離心結束后棄上清，加入Opti-MEM培養基1 mL吹打重懸，深低溫(-80℃)保存病毒液。

1.4 HMGN2 的過表達和蛋白純化 用過表達慢病毒(HMGN2-flagoe組)和空白慢病毒(oeCON組)感染HEK-293FT細胞。通過預實驗確定U-2OS細胞病毒感染的最佳感染復數(MOI)為10。為了增加陽性細胞的比例，在細胞感染3 d后進行流式分選，并繼續培養攜帶綠色熒光的細胞。當細胞培養至70%～80%融合時，收集并提取RNA，通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測過表達效率。確認HMGN2過表達效率后，收集過表達HMGN2的細胞，用NE-PER核蛋白提取試劑盒提取核蛋白，并應用FLAG M純化試劑盒純化HMGN2-flag蛋白。通過ELISA法(ab49763)檢測HMGN2的濃度。

1.5 RT-qPCR 使用SYBR Premix ExTaq和ABI Prism 7900HT進行RT-qPCR，定量測定HMGN2的表達水平。應用TRIzol提取每組細胞的總RNA，并使用反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA，用特異性引物進行擴增(以人β-actin基因為內參)。PCR引物序列：HMGN2正向為5′-CGA TTG TCT GCC CAT GTC CT-3′，反向為5′-GCA GAA CGT ACC CTG TTC CA-3′; β-actin正向為5′-ACC GAG CGC GGC TAC AG-3′，反向為5′-CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3′。采用2-ΔΔCt法分析并統計數據。用相同的樣品和相同的引物重復RT-qPCR實驗3次。

1.6 Western印記 使用NE-PER核蛋白提取試劑盒提取核蛋白。獲得的蛋白溶液在SDS-PAGE凝膠上電泳，分離的蛋白質條帶轉移到PVDF膜上，并在5%牛血清白蛋白中封閉，分別用抗HMGN2(1∶1 000稀釋，ab199679)和抗DDDDK(1∶1 000稀釋，ab49763)在4℃下孵育過夜，然后在室溫下用二抗孵育膜1 h。使用ECL曝光液顯影，并進行觀察、拍攝。

1.7 免疫細胞化學 用濃度為10 μg/mL的純化HMGN2蛋白處理骨肉瘤細胞24 h，然后將細胞用4%多聚甲醛固定30 min，用含0.1% Triton X-100的PBS溶液透化5 min，用1% BSA封閉細胞2 h。將細胞用抗DDDDK抗體(1∶100稀釋，ab49763)在4℃孵育過夜，然后用二抗孵育1 h，PBS洗滌后用DAPI封固。在共聚焦顯微鏡下觀察HMGN2-flag的細胞定位并拍攝。

2 結 果

2.1 HMGN2過表達慢病毒質粒構建 將獲得的HMGN2片段與慢病毒過表達質粒(圖1A)連接后進行轉化，獲得8個陽性菌落(圖1B，泳道5～12)；糖凝膠電泳顯示成功獲得HMGN2的基因片段(圖1C)，PCR產物大小為314 bp。將陽性菌送測序，結果顯示序列無誤，提取質粒進行慢病毒包裝。

2.2 HMGN2蛋白過表達與純化 以慢病毒感染的方式在HEK-293FT細胞中過表達HMGN2，以流式分選出陽性細胞后繼續培養，熒光顯微鏡下顯示細胞帶綠色熒光(圖2A)。RT-qPCR結果顯示，HMGN2-flagoe組HMGN2-mRNA的表達水平顯著高于oeCON組(P<0.001，圖2B)。Western印記結果顯示，HMGN2-flagoe組與oeCON組均有HMGN2表達，HMGN2-flagoe組HMGN2表達大于oeCON組，HMGN2-flagoe組HMGN2因帶標簽分子量較oeCON組稍大(圖2C)；HMGN2-flagoe組和Flag-BAP組中有flag表達，在oeCON組中未檢測其表達(圖2D)。

2.3 外源性HMGN2轉運骨肉瘤細胞及定位 用10 μg/mL的純化HMGN2-flag蛋白處理骨肉瘤細胞24 h后，免疫細胞化學檢測結果顯示，外源性HMGN2蛋白轉入骨肉瘤細胞，主要定位于細胞核(圖3)。

圖1 HMGN2過表達慢病毒質粒的構建

A: 質粒圖譜；B: PCR擴增凝膠電泳結果；C: 構建好的質粒轉化細菌后的菌液PCR驗證. 1：ddH2O空白對照；2：空載體對照；3：連接GAPDH的對照；4：Marker；5～12：8個陽性菌落結果

圖2 HMGN2蛋白過表達與純化

A: 白光下和綠色熒光下慢病毒感染的骨肉瘤細胞；B: 熒光定量PCR檢測HMGN2過表達效率；C: Western印記檢測純化HMGN2的表達;D: Western印記檢測flag的表達. oeCON組:空白載體對照；HMGN2-flagoe：帶有flag標簽的HMGN2純化蛋白； flag-BAP：攜帶flag標簽的融合蛋白，大小49.3 kDa.***P<0.001

圖3 免疫細胞化學實驗檢測外源性HMGN2細胞定位

3 討 論

骨肉瘤是一類極易在早期轉移的惡性腫瘤，約20%的骨肉瘤患者在明確診斷時即發現有轉移，而大多數患者即使在初診時未見轉移，也會隨著病情發展出現轉移[22]。骨肉瘤的主要治療方法是化療和外科手術，但是目前沒有有效的抗骨肉瘤轉移的治療策略，大部分患者仍會發生轉移，導致死亡[23-25]。因此，抗骨肉瘤轉移的研究成為這類腫瘤治療的重點。

HMGN2是高遷移率族蛋白(HMG)的一員，主要定位于細胞核，且僅在真核生物中表達，具有穩定核小體形態和調節基因轉錄的功能[26]。其是一種非組蛋白核蛋白，在脊椎動物和無脊椎動物的細胞中廣泛表達[27-28]。HMGN2蛋白含有核小體結合域(NBD)，其NBD的N末端與組蛋白結合，而C末端與DNA結合并調節轉錄[28]。HMGN2能增加DNA在核小體上的纏結角度，促進核衣殼結構重塑[29]。HMGN2功能缺陷能增加DT40細胞對紫外線的敏感性，使細胞凋亡率增加[30]。較多研究[10-15]顯示，HMGN2的異常表達與多種腫瘤的發生、發展有關聯。HMGN2高表達還具有抑癌效果。研究[16]表明，HMGN2可抑制口腔鱗狀細胞癌細胞系Tca8113的生長并誘導其凋亡。本課題組以往研究[17]發現，過表達HMGN2能抑制骨肉瘤細胞的轉移。除了直接抑制腫瘤細胞轉移外，Porkka等[19]還發現，HMGN2與腫瘤血管生成相關。

腫瘤轉移抑制和腫瘤靶向肽研究[31-32]表明，HMGN2可能是治療腫瘤轉移的潛在靶標。研究人員從牛肝中提取了一種含21個氨基酸的肽，稱為侵襲抑制劑2(IIF2)，且鑒定顯示其與HMGN2的C末端片段一致[31-32]。體外研究[32-34]顯示，該肽能抑制多個腫瘤細胞的轉移。而動物研究[32]表明，同時將IIF2和肺癌細胞經小鼠尾靜脈注射可使腫瘤細胞轉移減少50%～60%。 IIF2與白蛋白結合可提高其穩定性，并使轉移減少86%[33, 35]。上述研究表明，HMGN2可作為一類抑癌因子，應用于抗惡性腫瘤轉移。

重組慢病毒載體是一種常用且有效的將外源蛋白基因導入細胞的手段[36]，但是慢病毒載體的轉錄“通讀”現象可導致其整合位點附近原沉默基因被激活，這可能有潛在的危險性。因此需要尋找更為有效和安全的方式來增加腫瘤細胞內的HMGN2的含量。HMGN2能被某些細胞以外分泌的方式釋放到胞外。白細胞介素2(IL-2)可刺激人外周血單核細胞釋放HMGN2[19-20]；一些腫瘤細胞的表面抗原也能刺激CD8+T淋巴細胞釋放HMGN2[18]。這些研究提示，有可能通過外界刺激促使腫瘤旁正常組織或腫瘤附近的免疫細胞釋放足量的HMGN2，從而發揮其抗腫瘤作用。而這類外分泌的HMGN2轉運入腫瘤細胞是其發揮功能的基礎。本研究用純化HMGN2-flag融合蛋白處理骨肉瘤細胞，免疫細胞化學檢測顯示該外源性HMGN2能轉運入骨肉瘤細胞并定位于細胞核。此外，內源性HMGN2蛋白在細胞核的定位已被多項研究[37-38]證實，而外源性HMGN2蛋白入胞是其入核的先決條件，對其機制的深入研究能為未來相關藥物的研發提供依據。

綜上所述，過表達的HMGN2在人骨肉瘤細胞系中表現出抗腫瘤活性，而本研究成功制備了HMGN2蛋白，并經免疫細胞化學實驗證實外源性HMGN2能轉運入骨肉瘤細胞，從而為進一步研究其抗腫瘤轉移功能及新藥研發提供了基礎。下一步研究將對外源性HMGN2入胞后的抗腫瘤轉移能力和機制進行探索。