腫瘤微環境促進子宮內膜癌細胞分泌雌激素

車 祺， 劉素英， 董 曦

復旦大學附屬中山醫院生殖醫學中心，上海 200032

子宮內膜癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，發病率在發達國家占女性惡性腫瘤的第4位，在發展中國家占女性惡性腫瘤的第7位，且近年來呈持續上升趨勢[1]。子宮內膜癌的高發病率及高死亡率嚴重危害婦女健康及生存質量，早期診斷及有效治療至關重要[2]。

已有研究[3-4]證實，子宮內膜癌組織中雌激素的濃度高于正常組織，說明雌激素不僅能以傳統的內分泌方式作用于靶器官，還可能以局部分泌的方式，促進腫瘤的發展。芳香化酶是雌激素合成的限速酶，但是其在子宮內膜癌中的具體作用機制至今仍不清楚[5]。本研究通過子宮內膜癌細胞與間質細胞的共培養模型，研究子宮內膜癌細胞中芳香化酶及間質細胞中雌激素的合成關系，并篩查相關細胞因子。

1 資料與方法

1.1 子宮內膜癌間質細胞的提取 子宮內膜癌組織標本來自復旦大學附屬中山醫院。無菌條件下獲取子宮內膜癌組織，0.9%氯化鈉液洗滌，除去血塊及黏液后，剪成1 mm3左右小塊。離心后，加入0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫孵箱內消化。分別用100目和400目不銹鋼篩網過濾消化后的細胞懸液。

1.2 雙重免疫熒光染色鑒定間質細胞 細胞經甲醛固定，血清封閉后，同時用小鼠抗人波形蛋白抗體和兔抗人角蛋白抗體4℃孵育過夜；次日磷酸鹽溶液(PBS)沖洗，滴加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔 (綠色)熒光和羅丹明標記的羊抗小鼠(紅色)熒光二抗，避光放置2 h；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染細胞核，抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡觀察染色結果。

1.3 子宮內膜癌細胞系的選取和培養 選取雌激素受體(estrogen receptor, ER)陽性的子宮內膜癌細胞系RL95-2(ERα和ERβ均陽性)、HEC-1A(ERα和ERβ均陽性)和HEC-1B(ERβ陽性)，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養液培養， 在37℃、5% CO2培養箱培養。當細胞增殖至80%時，用0.25%胰酶(含有0.02%EDTA)消化傳代，每2～3 d換液或傳代1次，觀察細胞生長情況。

1.5 細胞培養模式及雌激素合成檢測 24孔細胞培養板購自美國Corning公司。Tanswell小室濾膜孔徑為0.4 μm，膜為聚碳酸酯膜，保證細胞之間不直接接觸，而培養液和可溶性因子可自由通過。共培養組24孔板下室中以2.3×105/L的密度接種子宮內膜癌間質細胞；Transwell小室中以(1～1.5)×105/L的密度接種3種子宮內膜癌細胞株(RL95-2、HEC-1A和HEC-1B)。單獨培養組只在Transwell小室中接種子宮內膜癌細胞株。2組均培養5 d后，留取一部分培養液用于后續芯片篩查細胞因子，余培養液用于檢測雌激素的含量。用化學發光免疫(UniCel DxI 800全自動化學發光免疫分析儀)雌激素的含量；熒光定量real-time PCR法檢測腫瘤細胞內芳香化酶mRNA的表達。

1.6 細胞因子芯片篩查 選取差異最明顯的一組細胞，留取細胞培養液上清，進行子宮內膜癌局部雌激素合成相關調控細胞因子的芯片篩查。人細胞因子芯片(RayBioTM抗體芯片)購自上海BioTNT公司，含507個人源性細胞因子抗體。根據芯片說明書，通過激光熒光檢測芯片信號，芯片亮度越強說明相應的細胞因子含量越高。

1.7 生長分化因子-15(GDF-15)刺激芳香化酶的表達 將RL95-2、HEC-1A和HEC-1B分別接種于24孔板，孵育24 h至密度70%～80%融合，PBS洗3遍，換無血清培養液孵育過夜，分別用5、10、20、50、100 ng/mL濃度的GDF-15刺激24 h，提取細胞mRNA，經real-time PCR檢測芳香化酶表達情況。

2 結 果

2.1 子宮內膜癌間質細胞鑒定 雙重免疫細胞熒光染色結果圖1顯示，間質細胞的特征性蛋白(波形蛋白)為陽性染色，上皮細胞的特征性蛋白(角蛋白)為陰性染色，證實成功提取和培養了子宮內膜癌間質細胞。

圖1 雙重免疫細胞熒光染色堅定子宮內膜癌間質細胞

2.2 雌激素合成和芳香化酶表達情況 結果(圖2)表明：共培養組培養上清中雌激素的濃度及腫瘤細胞中芳香化酶mRNA的含量均高于單獨培養組。

2.3 2組差異性表達細胞因子的篩選 HEC-1A細胞中芳香化酶的表達的在2組間差異性最大，因此將其用于細胞因子篩查，結果表明，與代謝相關的細胞因子中，2組GDF-15的表達差異性最大(P<0.01)，見圖3。

圖2 2種培養模式下上清液中雌激素和腫瘤細胞內芳香化酶mRNA的表達

圖3 2種培養模式下GDF-15的表達

2.4 不同濃度GDF-15對內膜癌細胞株芳香化酶表達的調節 real-time PCR結果(圖4)顯示：5、10、20、50、100 ng/mL的GDF-15刺激3種子宮內膜癌細胞株后，以10 ng/mL的GDF-15刺激細胞株中芳香化酶表達的作用最明顯(P<0.01)。

圖4 不同濃度的GDF-15對3種子宮內膜癌細胞株中芳香化酶表達的影響

3 討 論

長期過量的雌激素可誘發子宮內膜癌的發生[6]，而子宮內膜癌中雌激素濃度遠高于健康婦女血液和子宮內膜[3]。由此推測，子宮內膜癌中原位雌激素合成在其發生發展中起重要作用。芳香化酶是雌激素合成的限速酶，在卵巢的顆粒細胞、脂肪細胞、胎盤合體滋養層細胞和腦細胞等多種雌激素合成部位表達[5]。已有研究[7-8]表明，子宮內膜癌中芳香化酶的異常表達與腫瘤預后密切相關；在口服孕激素無效的絕經前子宮內膜癌患者中，芳香化酶抑制劑的治療效果較好。

本研究中，子宮內膜癌細胞與間質細胞共培養組培養液上清中的雌激素及腫瘤細胞中的芳香化酶mRNA含量均高于子宮內膜癌細胞單獨培養組，證實了腫瘤微環境對雌激素原位合成的作用。進一步培養液上清進行細胞因子芯片篩查，顯示共培養組GDF-15升高。

GDF-15是一種應激反應蛋白，1997年由Bootcov等[9]首次在激活的巨噬細胞中發現。其定位于19p12.1～13.1，含有2個外顯子和1個內含子，主要參與組織修復和調節器官生長、分化等生物學進程。GDF-15可促進腫瘤的轉移，但也可促進腫瘤細胞的凋亡，這2種相互矛盾的作用及具體機制尚未被完全闡明[10]。研究[11]顯示，血漿GDF-15的濃度可以作為前列腺癌、胰腺癌和結腸癌等多種惡性腫瘤的生物學預測指標。而且，GDF-15可以通過調節腫瘤微環境(如巨噬細胞的功能)來促進早期腫瘤的發展[12]。本研究中，GDF-15可以促進3種子宮內膜癌細胞株中芳香化酶的表達。由此推測，在子宮內膜癌微環境中，腫瘤間質細胞通過分泌GDF-15，調控癌細胞中芳香化酶的合成，進而導致子宮內膜癌原位雌激素的增加。

在卵巢癌患者血清中，GDF-15表達水平升高，可與CA125一起作為卵巢癌的早期診斷指標[13-14]。李會平等[15]發現，GDF -15 在子宮內膜癌組織中表達較高，且與肌層浸潤深度正相關。國外研究[16-17]也表明，子宮內膜癌患者血清GDF-15 水平與腫瘤的淋巴結轉移和預后密切相關，且可以作為腫瘤進展的獨立預測因子，因此可作為子宮內膜癌進展、復發和預后的有效預測指標。另外，GDF-15與肥胖及新陳代謝之間存在明顯的相關性[18]。GDF-15可通過延遲胃排空、激活末梢區神經元及促進脂肪分解的作用方式預防及治療肥胖[19]。本研究證實，GDF-15可促進子宮內膜癌中芳香化酶的表達，這可能是GDF-15促進子宮內膜癌發展的新機制。

腫瘤細胞通過產生多種生長因子和趨化因子，并以旁分泌的方式激活間質細胞而活化腫瘤基質，而間質細胞被腫瘤細胞誘導后，也產生多種細胞因子及酶，進一步促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[20]。正常細胞與周圍的組織微環境之間存在著動態平衡，進而使維持細胞的正常生長和凋亡。而腫瘤惡變則破壞了這一平衡[21]。本研究發現，子宮內膜癌中GDF-15可以促進局部雌激素合成，這一細胞因此可能成為子宮內膜癌發病機制研究和治療的潛在靶點。