NUCB2 和Bcl-2 在前列腺癌組織中的表達和相關性研究

劉 歡 羅振國** 陳向鋒 王麗強 單鏡源

1. 佳木斯大學附屬第一醫院泌尿男科（黑龍江佳木斯 154000）2. 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院（上海 200001）

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤之一，在中國，近年來前列腺癌的發病率一直在不斷增加， 它是導致男性因癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。 盡管我們在前列腺癌的診斷和輔助治療方面取得了相當大的進步， 但是迄今為止僅有低級別和局灶性前列腺癌治愈率達60%左右， 中晚期患者5 年生存率仍低于30%[2-3]，患者的總體生存率并未顯著提高。 因此對前列腺癌發生發展以及治療和預后的研究具有重要意義。 1992 年，Kanai Y，Tanuma S[4]等在小鼠及人細胞中發現了一種EF 手型鈣結合蛋白，并將其命名為核組蛋白（nucleobindin-2，NUCB2）。 目前發現NUCB2 具有特殊的結構功能，并且是一種癌癥相關基因，該基因在胃癌、乳腺癌、前列腺癌、腎透明細胞癌等組織中被相繼報道。 Bcl-2 即B 細胞淋巴瘤-2 基因，是目前研究的與凋亡關系十分密切的原癌基因之一， 可抑制細胞凋亡，延長其生長，導致腫瘤的發生[4]。

材料與方法

一、標本來源及分組

收集佳木斯大學附屬第一醫院病理科2010 年1月至2019 年1 月存檔前列腺石蠟標本，將病理組織分為三組，分別為前列腺癌組、前列腺上皮內瘤變組，以及前列腺良性增生組。 其中前列腺癌51 例、前列腺上皮內瘤變共39 例[低級別上皮內瘤變（LGPIN）18 例、高級別上皮內瘤變（HGPIN）21 例]、良性前列腺增生20例。兩位資深病理醫師嚴格復審所有標本。前列腺癌病例組患者年齡57～82歲，平均年齡72歲，大于、等于72歲者30 例，小于72 者21 例。 通過查閱病例，搜集患者術前血清前列腺特異性抗原(PSA)水平。 所有患者術前均未行放療、化療。前列腺癌組進行Gleason 評分，對同一腫瘤的主要結構和次要結構分別評分， 兩項評分相加總積分≤5 分者列為高分化組（10 例）、6～7 分者列為中分化組（19 例）、8～10 分者列為低分化組（22 例）。 對前列腺癌病例組進行隨訪， 共40 例患者滿足條件，其中5 年內死亡25 例，5 年以上存活15 例。

二、試劑

兔抗人NUCB2（nucleobindin2）多克隆抗體購自武漢優爾生商貿有限公司， 兔抗人Bcl-2 單克隆抗體，SP免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑購自北京中杉金橋生物技術公司。

三、主要方法

標本按理想實驗要求切片；60℃烤箱烘烤1 小時；二甲苯分梯度脫蠟；再用梯度酒精脫去二甲苯；PBS 和蒸餾水沖洗； 置于EDTA 抗原修復液PH9.0 高溫高壓抗原修復；切片至Tween 20,浸泡震蕩沖洗去污；切片至于3%的H2O2中滅活內源性酶及封閉內源性生物素，山羊血清抗原封閉；滴加配置好濃度的NUCB2 一抗、滴加即用型Bcl-2 一抗，常規孵育；滴加與一抗相匹配的二抗，再次孵育；每一步之間用PBS 沖洗3 次，每次3 分鐘；滴加顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間,用蒸餾水充分沖洗；蘇木精復染細胞核；封片，光學顯微鏡下觀察結果。 陽性結果判定由本院兩位病理科資深醫師在高倍鏡視野下，進行陽性結果判定；最終結果分為：陽性表達、高表達和低表達。

四、統計學方法

采用SPSS26.0 統計軟件進行統計學分析。NUCB2和Bcl-2 在前列腺癌、前列腺上皮內瘤變及良性前列腺增生組織中的表達采用χ2檢驗，以a=0.05 為顯著性檢驗水準，P＜0.05 為差異有統計學意義。NUCB2 和Bcl-2的相關性采用Spearman 相關分析， 以P＜0.05 為有統計學意義，并采用Spss 制作五年生存曲線。

結 果

一、NUCB2、Bcl-2 在前列腺癌、前列腺上皮內瘤變及良性前列腺增生組織中的表達

NUCB2 主要表達于腺上皮細胞胞質內， 呈棕黃色至棕褐色（如圖1）。 NUCB2 在BPH、LGPIN、HGPIN 及PCa 組陽性率分別為10%，11.11%，14.29%及70.59%。NUCB2 在PCa 組中的陽性率明顯高于BPH 組、LGPIN組和HGPIN 組，差異有統計學意義（P＜0.05 見表1）。

Bcl-2 主要表達于正常前列腺的腺上皮細胞以及前列腺癌細胞的細胞質（如圖2），在BPH、LGPIN、HGPIN 及PCa 組陽性率分別為15%，27.78%，52.29%及76.74%。 在PCa 組中的陽性率明顯高于BPH 組、LGPIN 組和HGPIN 組，差異有統計學意義（P＜0.05 見表1）。

圖2 Bcl-2 在前列腺癌中的陽性表達（SP，×200）

圖3 NUCB2 在前列腺增生中的陰性表達（SP，×200）

圖4 Bcl-2 在前列腺增生中的陰性表達（SP，×200）

二、NUCB2 和Bcl-2 的表達與前列腺癌臨床病理參數的關系

在前列腺癌組織中，NUCB2 表達與患者年齡無關（P＞0.05）；與Gleason 評分和術前血清PSA 值有關，隨著Gleason 評分的增高，NUCB2 的表達率也增高，同樣隨著術前血清PSA 值的增加，NUCB2 的表達率也增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。生存期小于5 年病例的NUCB2 表達陽性率高于生存期大于、等于5 年病例，差異有統計學意義（P＜0.05 見表2）。

Bcl-2 表達與患者年齡、5 年生存率均無關，差異無統計學意義 （P＞0.05）； 與Gleason 評分和術前血清PSA 值有關，隨著Gleason 評分的增高，Bcl-2 的表達率也增高， 同樣隨著術前血清PSA 值的增加，Bcl-2 表達率也增高，差異有統計學意義（P＜0.05 見表2）。

表2 NUCB2 和Bcl-2 表達與前列腺癌臨床病理因素的關系

三、NUCB2 與Bcl-2 在高級別上皮內瘤變組和高分化前列腺癌組中的表達

NUCB2 在高分化PCa 組中陽性表達率高于HGPIN 組，差異有統計學意義（P＜0.05），而Bcl-2 在高分化PCa 組中陽性表達率也高于HGPIN 組，但差異無統計學意義（P＞0.05 見表3）。

表3 NUCB-2 和Bcl-2 在HGPIN 組和高分化PCa 組中的表達

四、NUCB2 表達與PCa 預后的關系

預后分析得知， 前列腺癌組中， 共有40 人滿足5年生存率調查。 NUCB2 組中， 小于5 年生存的25 人中，23 人陽性表達，2 人陰性表達；大于、等于5 年生存的15 人中，9 人陽性表達，6 人陰性表達， 陽性和陰性患者間術后生存差異有統計學意義（P＜0.05，如圖5）。

Bcl-2 組中，小于5 年生存的25 人中，18 人陽性表達，7 人陰性表達；大于、等于5 年生存的15 人中，9 人陽性表達，6 人陰性表達， 陽性和陰性患者間術后生存差異無統計學意義（P＞0.05 見表2，如圖6）。

圖5 NUCB2 表達與PCa 術后生存曲線

圖6 Bcl-2 表達與PCa 術后生存曲線

五、前列腺癌中NUCB2 與Bcl-2 表達的相關性

NUCB2、Bcl-2 在前列腺癌組織中的表達呈正相關性（P＜0.05，見表4）。

表4 前列腺癌組織中NUCB2 和Bcl-2 表達的相關性分析結果

討 論

前列腺癌患者主要為老年男性， 近年來發病率呈現明顯上升趨勢， 目前前列腺癌位居我國男性泌尿生殖系統惡性腫瘤中發病率的第三位[6]因此，對前列腺癌的發生機制、演變過程的研究已成為亟待解決的問題。在前列腺癌方面的治療上， 基因治療會成為下一步研究的熱點，尤其是對中、晚期局部及全身轉移的前列腺癌患者，具有很大的潛在優勢。

NUCB2 也稱為NEFA 蛋白， 是一種新的腫瘤相關基因，最近研究發現與乳腺癌的復發和不良預后密切相關[7]，而且體外細胞實驗結果顯示能夠有效的增加乳腺癌細胞系的增殖、轉移和侵襲能力。 所有的結果都顯示和乳腺癌的轉移密切相關，而且可以作為預測乳癌預后的一個重要指標[7]。 在正常胃組織中NUCB2 表達水平較高，主要陽性分布于胃粘膜泌酸腺內分泌細胞。 應用RT-PCR 檢測方法， 分析比較胃癌組織和癌旁組織內NUCB2 mRNA 的變化，發現在胃癌組織中NUCB2 m RNA 水平下調50%，在胃癌組織中NUCB2 呈現出一種腫瘤抑制基因的特點[8-9]。 也有研究采用免疫組織化學、免疫印跡以及qRT-PCR 進行檢測，腎透明細胞癌組織中NUCB2 表達水平明顯高于相鄰的非癌變組織[10]。

本實驗顯示NUCB2 在前列腺癌組中的表達明顯高于良性前列腺增生組和前列腺上皮內瘤變組， 差異有統計學意義 （P＜0.05）， 本實驗顯示， 在PCa 組中NUCB2 表達與年齡無關（P＞0.05），與腫瘤的Gleason分級、術前血清PSA 相關，差異有統計學意義（P＜0.05），血清PSA—直被認為是前列腺癌的理想分子標志物，被廣泛應用于前列腺癌的發生、 進展及前列腺癌復發后的隨訪等過程中。 隨著術前血清PSA 值的升高，NUCB2 蛋白的表達率也增高。 前列腺癌Gleason 評分與前列腺癌的生物學行為和臨床預后之間具有很好的關聯性，隨著Gleason 分級的增加，評分越高，前列腺癌分化越差，NUCB2 表達率越高，提示NUCB2 表達可能與癌癥的進展和分化有關。 NUCB2 在小于5 年與大于、等于5 年生存期病例中的表達存在差異，差異有統計學意義（P＜0.05），提示NUCB2 的異常表達可能與前列腺癌的預后有關。 HGPIN 目前認為是一種癌前病變， 其組織學形態與生物學行為與PCa 尤其是高分化前列腺癌相似并有關聯。 本組實驗顯示在高分化PCa組中NUCB2 陽性表達高于HGPIN 組， 差異有統計學意義，提示其可能有助于二者的鑒別診斷。

近年來研究發現，細胞凋亡在前列腺癌發生、發展中起著至關重要的作用， 凋亡失衡是引起腫瘤細胞發生和增殖的重要影響因素， 也是導致惡性腫瘤治療失敗的主要原因之一。 Bcl-2 作為調控凋亡的重要基因產物受到廣泛關注，其可以抑制多種組織的細胞凋亡，在腫瘤的發生中發揮著原癌基因的作用[12]。

本實驗中顯示Bcl-2 在前列腺癌組中的表達明顯高于良性前列腺增生組和前列腺上皮內瘤變組， 差異有統計學意義（P＜0.05），提示Bcl-2 可能參與了前列腺癌的發生。 在PCa 組中Bcl-2 表達與年齡無關（P＞0.05），與腫瘤的Gleason 分級、術前血清PSA 相關，差異有統計學意義（P＜0.05），隨著Gleason 分級的增加，Bcl-2 表達率越高，提示Bcl-2 達可能與癌癥的進展和分化有關。Bcl-2在小于5 年與大于、 等于5 年生存期病例中的表達有差異，但差異無統計學意義（P＞0.05），在高分化PCa 組和HGPIN 組中表達存在差異，但無統計學意義（P＞0.05）。

NUCB2 是一種新近發現的與惡性腫瘤相關的生物學指標，該基因的表達與細胞抵抗力密切相關，通過抑制組織細胞凋亡實現延長細胞壽命的現象[13]，并且具有其獨特的結構域及相應的功能，陳美霓[14]等發現前列腺癌組織Bcl-2 表達增強，并通過抑制細胞的凋亡而促進腫瘤的發生和進展，Bcl-2 作為重要的凋亡因子在人體細胞凋亡中起著至關重要的作用。 通過Spearman 相關性分析得知NUCB2、Bcl-2 在前列腺癌組織中的表達呈正相關性（P＜0.05）。 NUCB2 和Bcl-2 隨著前列腺癌的發生，表達逐漸增強，兩者的正相關性提示它們之間可能存在一種相互作用機制。 是否能提示在前列腺癌組織中NUCB2 的高表達引起Bcl-2 增加，影響細胞凋亡過程,破壞細胞凋亡平衡，最終導致腫瘤的發生。

NUCB2 和Bcl-2 與前列腺癌的發生、 發展密切相關， 檢查其表達水平對疾病鑒別診斷和預后評估都有一定幫助, 對鑒別高分化PCa 和HGPIN 提供一種新思路。 目前NUCB2 與Bcl-2 之間的相互關系以及生物學功能方面的研究還比較少， 尤其是在腫瘤中的相互作用機制，需要進行更詳細的研究。