不同單因素對“龍牧801”紫花苜蓿總黃酮提取率的影響

李晨陽，黃明奇，李傳崢，劉丹，蘭文麗，楊陳晨，李波

不同單因素對“龍牧801”紫花苜蓿總黃酮提取率的影響

李晨陽，黃明奇，李傳崢，劉丹，蘭文麗，楊陳晨，李波

（齊齊哈爾大學(xué) 1. 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

以龍牧801苜蓿干粉為材料，采用索式提取法，對影響苜蓿總黃酮提取率的4個(gè)單因素的不同水平進(jìn)行比較，以確定各因素下苜蓿黃酮最大提取率．結(jié)果表明，在不同固液比、乙醇體積濃度、浸提時(shí)間和浸提溫度提取條件下，物料比為1∶30（g/mL），乙醇體積濃度為70%，提取時(shí)間為3 h，提取溫度為90℃，苜蓿總黃酮提取率可達(dá)9.48 mg/g．

龍牧801苜蓿；總黃酮；提取率；單因素

紫花苜蓿（L.）是豆科苜蓿屬草本植物，其種植歷史悠久，且分布廣泛，營養(yǎng)價(jià)值豐富，具有“牧草之王”的美稱[1]．紫花苜蓿富含多種蛋白質(zhì)、皂苷類、黃酮類、苜蓿多糖和氨基酸等[2]．黃酮類化合物屬于多酚類物質(zhì)，存在于很多植物尤其是高等植物體內(nèi)．根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物的生物活性非常強(qiáng)大，具有抗氧化性和抗病毒活性等功能[3-5]．索氏提取法是一種傳統(tǒng)的萃取化合物的方法，其基本原理是通過虹吸原理對物質(zhì)進(jìn)行多次萃取，從而提高所需化合物的提取率[6]．本研究以紫花苜蓿為原材料，利用索氏提取器，通過單因素實(shí)驗(yàn)探究紫花苜蓿中總黃酮提取的最佳工藝條件．

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

以龍牧801苜蓿鮮草作為實(shí)驗(yàn)材料，將其置于陰涼通風(fēng)處風(fēng)干，再通過粉碎機(jī)粉碎制作成干粉，以備實(shí)驗(yàn)使用．

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與回歸方程的確立實(shí)驗(yàn)依據(jù)荊常亮[7]對紫花苜蓿總黃酮提取、純化及其抗氧化活性研究中的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，稱取5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解并定容至25 mL，配制成0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)品溶液備用．采用NaNO2/Al（NO3）3顯色法對標(biāo)品溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，準(zhǔn)確吸取 0，1，2，3，4，5，6 mL 標(biāo)品溶液于具塞試管中，依次添加60%乙醇（5 mL），5% NaNO2溶液（1 mL），10% Al（NO3）3溶液（1 mL），4%的NaOH溶液（10 mL）．靜置15 min后加去離子水定容至25 mL，在 510 nm波長下測量OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)方程為=0.111-0.005 9（2=0.9973）．

1.2.2固液比對索氏提取苜蓿總黃酮的影響稱苜蓿草粉2.00 g，以浸提時(shí)間3 h，溫度90 ℃，體積濃度為70% 的乙醇為基本提取條件，分別設(shè)定1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 不同固液比提取苜蓿總黃酮，分析固液比對索氏提取紫花苜蓿總黃酮提取率的影響．

1.2.3乙醇體積濃度對索氏提取苜蓿總黃酮的影響稱苜蓿草粉2.00 g，以固液比1∶30，浸提時(shí)間3 h，浸提溫度90℃為基本提取條件，分別用40%，50%，60%，70%，80%，90% 不同乙醇體積濃度提取苜蓿總黃酮，探究不同體積濃度的乙醇對索氏提取紫花苜蓿黃酮提取率的影響．

1.2.4浸提溫度對索氏提取苜蓿總黃酮的影響稱苜蓿草粉2.00 g，以固液比1∶30，乙醇體積濃度70%，提取時(shí)間3 h為基本實(shí)驗(yàn)條件，分別采用80，85，90，95℃ 不同溫度提取苜蓿總黃酮，探究不同溫度對索氏提取苜蓿總黃酮提取率的影響．

1.2.5浸提時(shí)間對索氏提取苜蓿總黃酮的影響稱苜蓿草粉2.00 g，以固液比1∶30，提取溫度90℃，乙醇體積濃度70%為基本提取條件，再分別以2，2.5，3，3.5，4 h 不同浸提時(shí)間提取苜蓿總黃酮，探究不同提取時(shí)間對索氏提取苜蓿總黃酮提取率的影響．

2　結(jié)果與分析

2.1　不同因素對苜蓿總黃酮提取的影響

2.1.1固液比對苜蓿總黃酮提取率的影響在乙醇體積濃度為70%，提取溫度為90 ℃，浸提時(shí)間3 h的條件下，不同固液比對苜蓿總黃酮提取率的影響見圖1．由圖1可見，隨著乙醇用量的增加，苜蓿總黃酮提取率呈先增后降的趨勢，固液比為1∶10時(shí)，總黃酮提取率最低為5.606 mg/g；固液比為1∶30時(shí)，總黃酮提取率最高為8.218 mg/g．在1∶20，1∶30，1∶40，1∶50的固液比條件下，總黃酮提取率的變化差異不顯著（＞0.05），當(dāng)固液比為1∶60時(shí)總黃酮提取率急劇下降，固液比為1∶30時(shí)，苜蓿總黃酮提取率達(dá)最大值，其總黃酮提取率略高于1∶20，1∶40，1∶50的固液比水平．1∶10，1∶60固液比顯著影響苜蓿總黃酮的提取率，綜合考慮固液比對苜蓿黃酮提取率的影響，可選擇1∶30為本因素的最佳水平．但在1∶20，1∶30固液比條件下對苜蓿總黃酮提取率沒有大的差異，因此在為了節(jié)約原料前提下，提取苜蓿黃酮也可選擇物料比為1∶20．

2.1.2乙醇體積濃度對總黃酮提取率的影響在固液比1∶30，溫度90℃，浸提時(shí)間3 h為基本提取條件下，不同體積濃度乙醇對苜蓿總黃酮提取率的影響見圖2．由圖2可見，隨著乙醇體積濃度的增加，苜蓿總黃酮提取率呈先增后降的趨勢，乙醇體積濃度為40%時(shí)，總黃酮提取率最低，為4.142 mg/g；乙醇體積濃度為70%時(shí)，總黃酮提取率最高，為8.218 mg/g．乙醇體積濃度過高或過低對苜蓿總黃酮提取率的影響均比較大，在乙醇體積濃度超過70%時(shí)，對苜蓿黃酮提取率未達(dá)到促進(jìn)作用，因此可選擇體積濃度 70% 的乙醇提取苜蓿總黃酮．

圖1　物料比對總黃酮提取率的影響

圖2　乙醇體積濃度對總黃酮提取率的影響

2.1.3浸提溫度對總黃酮提取率的影響在固液比1∶30，乙醇體積濃度70%，提取時(shí)間3 h為基本提取條件下，不同浸提溫度對苜蓿總黃酮提取率的影響見圖3．由圖3可見，隨著浸提溫度的增加，苜蓿總黃酮提取率呈先增后降的趨勢，浸提溫度為80℃時(shí)，總黃酮提取率最小，為6.597 mg/g；浸提溫度為90℃時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值，為8.218 mg/g．當(dāng)浸提溫度再增加時(shí)，未能促進(jìn)總黃酮提取率的增加，因此90 ℃為苜蓿總黃酮浸提溫度的最佳水平．

2.1.4浸提時(shí)間對總黃酮提取率的影響在固液比1∶30，乙醇體積濃度70%，提取溫度90℃為基本提取條件下，不同浸提時(shí)間對苜蓿總黃酮提取率的影響見圖4．由圖4可見，隨著浸提時(shí)間的增加，苜蓿總黃酮提取率呈先增后降的趨勢，浸提時(shí)間為2 h時(shí)，總黃酮提取率最低為5.516 mg/g；浸提時(shí)間為3 h時(shí)，總黃酮提取率最大，為8.218 mg/g．當(dāng)浸提時(shí)間超過3.5 h，總黃酮提取率開始下降，說明苜蓿總黃酮提取率未能通過增加浸提時(shí)間而增加，因此苜蓿總黃酮浸提3 h為最佳浸提時(shí)間．

圖3　浸提溫度對總黃酮提取率的影響

圖4　浸提時(shí)間對總黃酮提取率的影響

2.2　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對索氏提取法提取苜蓿總黃酮各單因素的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)．在物料比為1∶30，乙醇體積濃度為70%，提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間為3 h條件下，提取的苜蓿總黃酮提取率為9.48 mg/g，此條件下提取的苜蓿總黃酮超過本實(shí)驗(yàn)所有各單因素提取條件下的黃酮提取率．

3　討論

各種材料進(jìn)行黃酮類物質(zhì)提取的研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)均采用乙醇作為提取溶劑，且乙醇的體積濃度大都在70%左右．在黃酮提取過程中乙醇的體積濃度主要受樣品所含色素的有無及多少影響，色素含量少的樣品，所用的乙醇體積濃度相對就高，反之，提取黃酮所需的乙醇體積濃度相對就低[8]．本實(shí)驗(yàn)篩選的乙醇體積濃度為70%時(shí)，能有效增加紫花苜蓿總黃酮的最大提取率，這與文獻(xiàn)[7]采用3種不同的提取方法提取紫花苜蓿總黃酮，其回流浸提法的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積濃度70%的結(jié)果一致．

在一定范圍內(nèi)，液料比增加有利于系統(tǒng)濃度增加，進(jìn)而增加有效成分與溶劑的接觸機(jī)會，有利于黃酮類化合物的溶出[9]．文獻(xiàn)[7]采用3種不同的提取方法提取紫花苜蓿總黃酮，其回流浸提法的最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶20，與本實(shí)驗(yàn)篩選紫花苜蓿黃酮最佳物料比為1∶30的結(jié)果略有差異．

隨著提取時(shí)間的增加，索氏提取器中回流次數(shù)增加，進(jìn)而提高苜蓿總黃酮的提取率．索氏提取法利用溶劑回流和虹吸原理，讓乙醇溶劑連續(xù)不斷萃取固體物質(zhì)，既節(jié)約溶劑同時(shí)也提高了萃取效率[10]．本實(shí)驗(yàn)采用索氏提取法，浸提溫度90℃，浸提時(shí)間3 h所得總黃酮量均為5~9 mg/g，與文獻(xiàn)[7]采用回流浸提方法提取紫花苜蓿總黃酮，提取時(shí)間4 h的結(jié)果略有差異．

4　結(jié)論

利用索式提取法對苜蓿黃酮提取率的物料比、乙醇體積濃度、浸提溫度和浸提時(shí)間4個(gè)單因素的不同水平進(jìn)行比較，在物料比為1∶30（g/mL），乙醇體積濃度為70%，提取時(shí)間為3 h，提取溫度為90℃，最佳的苜蓿總黃酮提取率可達(dá)9.48 mg/g．

[1] 王成章，文開新，史瑩華，等．紫花苜蓿黃酮的提取與純化工藝初探[J]．草地學(xué)報(bào)，2013，21（2）：365-371

[2] 李小云，劉慶，田光輝．苜蓿中生物活性成分研究進(jìn)展[J]．飲料工業(yè)，2012，15（12）：8-10

[3] 文開新，王成章，嚴(yán)學(xué)兵，等．黃酮類化合物生物學(xué)活性研究進(jìn)展[J]．草業(yè)科學(xué)，2010，27（6）：115-122

[4] 趙婭敏，馬好文，孟淑娟．紫花苜蓿中黃酮類化學(xué)成分及其生物活性研究進(jìn)展[J]．中草藥，2013，44（22）：3245-3252

[5] 陳秋榮．黃酮類化合物藥理作用的分析[J]．中國實(shí)用醫(yī)藥，2012，7（21）：254-255

[6] 關(guān)雅瓊，張曜武，楊浩．索氏提取器的起源與發(fā)展[J]．天津化工，2011，25（3）：17-20

[7] 荊常亮．紫花苜蓿總黃酮的提取、純化及其抗氧化活性研究[D]．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2016

[8] 文開新．紫花苜蓿黃酮的提取與純化研究[D]．鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011

[9] 閆琳娜．松針落葉總黃酮的提取、純化及抗氧化性能分析[D]．長春：吉林大學(xué)，2009

[10] 傅春燕，羅聰，龍佳欣，等．龍牙百合總黃酮的索氏提取工藝正交優(yōu)化及抗氧化性研究[J]．邵陽學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2019，16（5）：64-72

Effects of different single factors on the extraction rate of total flavonoids fromL. cv. longmu No.801

LI Chenyang，HUANG Mingqi，LI Chuanzheng，LIU Dan，LAN Wenli，YANG Chenchen，LI Bo

（1. School of Life Sciences and Agriculture Forestry，2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）

UsingL. cv. longmu No.801 powder as material，the extraction of total flavonoids from alfalfa was studied．Compared the effects of four single factors on the extraction rate of total flavonoids in alfalfa．In order to determine the maximum extraction rate of Alfalfa flavonoids under various factors．The results showed that under the conditions of different solid-liquid ratio，ethanol concentration，extraction time and extraction temperature，the material ratio was 1∶30（g/mL），ethanol volume fraction was 70%，extraction time was 3 h，extraction temperature was 90 ℃，and total flavonoids extraction rate of alfalfa was 9.48 mg/g．

L. cv. longmu No.801；total flavones；extraction rate；single factor

Q94

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2020.03.016

1007-9831（2020）03-0083-04

2019-11-02

黑龍江省省屬高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目（135209267，YSTSXK201886）；齊齊哈爾大學(xué)2019年研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（YJSCX2019043）；齊齊哈爾大學(xué)2019年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201910232343）；齊齊哈爾市科技計(jì)劃項(xiàng)目（NYGG-201916）

李晨陽（1995-），男，黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士研究生，從事植物代謝產(chǎn)物提取研究．E-mail：501257387@qq.com

李波（1962-），女，遼寧鞍山人，教授，從事細(xì)胞生物學(xué)研究．E-mail：libo1962@163.com