PHF7 在人精子中相互作用蛋白分析

曹夢陽 林浩成* 姜 輝*

1. 北京大學第三醫院泌尿外科（北京 100191）2. 北京大學第三醫院生殖醫學中心（北京 100191）3. 北京大學第三醫院男科（北京 100191）4. 北京大學第三醫院人類精子庫（北京 100191）

約15%的育齡夫婦受到不孕不育的困擾， 其中男性因素導致的不育約占50%[1]。 男性不育癥是由多種疾病和因素造成的結果， 但超過一半的男性不育患者無法找到明確的病因，臨床上稱為特發性男性不育，目前認為其發病與遺傳和環境等因素有關。 因此，從分子遺傳學的角度精確的闡釋生精功能障礙的發病機制，是未來治療特發性男性不育癥的基礎。 植物同源結構域指蛋白7（PHD finger protein 7，PHF7）屬于RING 型泛素連接酶家族，在人和小鼠的睪丸組織中特異性表達[2]。PHF7 在2002 年被首次報道，Junhua Xiao 等研究了一例PHF7 基因缺陷的生精阻滯患者，認為其具有轉錄調控及調節精子發生的作用[3]。 2012 年，Shuyuan Yang 等發現，PHF7 可以調控果蠅性別分化過程， 這種調控作用可能與其識別組蛋白甲基化修飾H3K4me2 有關[4，5]。在本研究中，我們在體外表達GST-PHF7 融合蛋白，篩選其在人精子中的相互作用蛋白， 并通過生物信息學方法對其進行富集，從蛋白質層面探明PHF7 及其互作蛋白在精子發生中的調節通路，為進一步研究PHF7 及其互作蛋白的調控網絡和分子機制打下基礎， 并為基因突變引起的男性不育的診斷和治療提供理論依據。

材料與方法

一、GST-PHF7 表達載體的構建

全基因合成少量質粒作為模板， 設計引物Plasmid-PHF7-F （ 序 列5'—3'：GATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGAAGACTGTAAAAGAAAAGAAG） 及Plasmid-PHF7-R （ 序 列 5'—3'：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTTACTTGGATTTTTTGCAGC） 并 使 用PrimeSTAR 高保真酶（Takara，R045A）擴增目的基因，反應條件：96℃20s，60℃30s，72℃1min， 共30 個循環。 PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，切取含目的基因片段的條帶，使用DNA 回收試劑盒（生工，B518131）回收DNA 目的片段，得到目的基因PCR 產物。

取5μg 的pGEX-4T-1 載體， 用BamHI 和XhoI 在37℃雙酶切30min，電泳回收載體片段。 按照如下方案配置目段片段與載體連接的反應體系：pGEX-4T-1 載體片段100ng，PHF7 PCR 產物100ng，5x CE II Buffer 4μL，ExpressII （諾唯贊，C112-2）2μL，ddH2O 補充到20μL。 37 ℃連接30min 后， 取10μL 連接產物至100 μL Stbl3 感受態細胞中冰浴30 min，42 ℃水浴60s，然后快速將其轉移至冰浴中2～3 min。 加入300μL LB 培養基，37℃振蕩培養1 h，將菌液均勻涂布于含Amp 抗生素（100 μg/mL）的LB 平板上，室溫下放置，至液體吸收。倒置平板，轉移入37 ℃生化培養箱過夜培養。挑選菌落進行PCR 鑒定陽性轉化，菌落PCR 鑒定得到的陽性克隆，送測序公司進行測序驗證。 經測序驗證正確的陽性克隆進行質粒小提（生工，B518191）。

二、GST-PHF7 融合蛋白的表達與純化

挑取表達GST 標簽重組蛋白的單克隆， 接種到3mL 含Amp 抗生素的LB 培養液中，培養過夜。 按照1:100 的比例取培養過夜的菌液，接種到預熱至37℃并含Amp 抗生素的LB 培養液中，37℃常規培養60min至菌液的OD600 達到0.6 左右。 將菌液在冰上靜置，加入IPTG 至終濃度為0.5mM 28℃進行誘導。 收集菌液至離心管中，4℃1500g 離心3min， 棄上清， 收集沉淀。 以PBS 50 倍體積進行濃縮。1000pa 壓力進行壓力破碎，共重復7 次。 1500g 離心20min，取上清進行后續純化。

將制備好的含有GST 融合蛋白的澄清細胞裂解液加入到層析柱中，流速控制為10～15cm/h。 裂解液全部流出層析柱后就立刻加入1×PBS 清洗柱子， 所需量大約為柱體積的20 倍。 用10～15 倍柱體積的現配10mM谷胱甘肽洗脫液 （0.154g 還原性谷胱甘肽溶于50 mL 50 mM Tris-HCl,pH 8.0） 洗脫融合蛋白。 分別吸取20μLGST 融合蛋白原液、流出液、洗滌液和洗脫液，通過SDS-PAGE 電泳分析各樣品， 確定是否存在標簽蛋白。洗脫液通過分子篩（30Kda 超濾管）去除游離的谷胱甘肽并濃縮。

三、精子總蛋白提取

收集2018 年10 月到11 月在北京大學第三醫院男科精液檢查室的精液廢棄標本，根據WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版[6]，篩選出精子濃度和活力均正常的精液標本。 取15mL 離心管，依次加入2mL 90% percoll，45% percoll 和液化精液， 保持各液體之間的界面清晰，300 g 離心20 min。 去上清后用PBS清洗細胞沉淀2 次，向其中加入蛋白裂解液（已加蛋白酶抑制劑），冰上裂解15min，500g 4℃離心15min，取上清到新的EP 管中即為精子總蛋白。

四、GST pull-down 實驗

取GST 空載菌和GST-PHF7 菌， 加入PBS 溶液，渦旋震蕩混勻，4℃1500g 離心5min，去上清，重復洗滌沉淀兩次。 加入裂解液，吹打混勻后冰上裂解，5%功率超聲5min。 4℃1500g 離心15min，上清轉移到新的EP管中，做好標記，從每管中取50uL 作為input。取適量樹脂到EP 管中， 加入1mL 細胞裂解液， 室溫漂洗2min，500g 4℃離心5min，去掉液體，在漂洗兩次后，加入上清，在EP 管上做好標記，命名為GST 組+精子蛋白、GST-PHF7 組+裂解液、GST-PHF7 組+ 精子蛋白，放入4℃混勻儀上孵育2h。 從4℃混勻儀上拿出樹脂，4℃500g 離心5min，去上清，向樹脂中加入1mL 裂解液， 放混勻儀上， 室溫漂洗5min 后，4 ℃500g 離心5min，去上清重復漂洗兩次。 將提取的精子細胞蛋白加入到相應的樹脂組別中，放4℃混勻儀上孵育過夜。 孵育完畢后4℃500g 離心3min，棄上清。 將樹脂用裂解液洗3 次， 用新鮮配置的20mM 還原性谷胱甘肽洗脫15min。 4℃1500g 離心5min,上清即為pull-down 產物。將3 組pull-down 產物進行質譜檢測。

五、質譜檢測與生信分析

將樣品進行質譜檢測，獲取與PHF7 特異結合的蛋白序列和分子量等信息， 該部分委托廣州駿輝生物科技有限公司完成。 使用Gene Ontology 數據庫（https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）進 行GO 富 集 分 析[7]； 使 用KEGG pathway 數 據 庫（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）信號通路富集分析[8]；使用在線軟件Omics-Bean（http//www.omicsbean.cn）作圖。

實驗結果

一、GST pull-down 實驗與質譜分析

GST 組+ 精 子 蛋 白、GST-PHF7 組+ 裂 解 液、GST-PHF7 組+ 精子蛋白三組pull-down 產物SDSPAGE 結果如圖1 所示，可見GST-PHF7 組+精子蛋白組與另外兩組條帶有明顯差異。 結果表明，本次實驗用誘餌蛋白成功釣取了精子細胞中的結合蛋白。 將pull-down 產物進行質譜檢測， 質譜得到的GST-PHF7的結合蛋白除去GST 對照組鑒定的蛋白后， 共鑒定到75 個直接或間接相互作用的蛋白。 對這些蛋白進行注釋，注釋出組蛋白及其變體、轉錄因子、氧代謝相關蛋白等。

圖1 GST pull-down 實驗考染膠圖

二、PHF7 相互作用蛋白的GO 富集分析

對質譜得到的蛋白依次從生物學過程（Biological Process，BP），細胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecule Function，MF）層面進行GO 功能富集分析，共注釋出BP 條目2273 個，其中有統計學意義的條目（P＜0.05）1377 個；注釋出CC 條目375 個，其中有統計學意義的條目（P＜0.05）236 個； 注釋出MF 條目401 個，其中有統計學意義的條目（P＜0.05）240 個。 各自取可信程度最高（根據P 值排列）的10 個條目，結果如圖2 所示。

圖2 PHF7 互作蛋白在生物學過程、細胞組分和分子功能層面的富集分析

PHF7 互作蛋白涉及到蛋白運輸(intracellular protein transport)，細胞內定位(cellular localization)，藥物代謝（Drug metabolic process）和分解代謝(Catabolic process)等多個生物學過程，根據P 值篩選出可信度最高的10 個條目繪制氣泡圖如圖3 所示。 PHF7 互作蛋白所涉及的分子功能在level 4 水平上,富集蛋白最多的是細胞器復合體代謝（Organonitrogen compound metabolic process）和運輸（transport）的分布如圖4 所示。 每個蛋白可能同時分屬不同的生物學過程， 若將每個蛋白依據P 值大小歸到可信程度最高的條目下， 涉及蛋白最多的條目是藥物代謝（Drug metabolic process），其分布如圖5 所示。

圖3 PHF7 互作蛋白涉及的可信度最高的10 個生物學過程

圖4 PHF7 互作蛋白涉及的生物學過程在level4 水平上的分布

圖5 PHF7 互作蛋白涉及的生物學過程分布餅圖

PHF7 互作蛋白主要定位在各種胞內細胞器（intracellularvesicle），細胞質(cytoplasm)，囊泡(vesicle)，外泌體(extracellular exosome)等，涉及胞內蛋白運輸和分泌的多個環節， 這些細胞成分在level4 水平上的分布如圖6 所示。每個蛋白可能同時分屬不同的細胞成分條目，若將每個蛋白依據P 值大小歸到可信程度最高的條目下，64%的蛋白定位于胞外膜界細胞器（Extracellular membrane-bounded organelle），其次是胞質（cytoplasm），其分布如圖7 所示。

圖6 PHF7 互作蛋白所涉及的細胞成分在level4 水平上的分布

圖7 PHF7 互作蛋白所涉及的細胞成分分布餅圖

PHF7 互作蛋白涉及到蛋白結合（protein binding），RNA 結合(RNAbinding)和酶結合(enzymebinding)等分子功能， 根據P 值篩選出可信度最高的10 個條目繪制氣泡圖如圖8 所示。 PHF7 互作蛋白所涉及的分子功能在level 4 水平上的分布如圖9 所示,識別與結合核酸是其主要分子功能。每個蛋白可能同時分屬不同的分子功能條目，若將每個蛋白依據P 值大小歸到可信程度最高的條目下，71%的蛋白分子功能被歸類于蛋白結合，其分布如圖10 所示。

圖8 PHF7 互作蛋白涉及的可信度最高的10 個分子功能

圖9 PHF7 互作蛋白分子功能在level4 上的分布

圖10 PHF7 互作蛋白所涉及的分子功能分布餅圖

三、PHF7 相互作用蛋白的KEGG 分析

KEGG 數據庫中，信號通路分為以下6 個亞類：代謝（metabolism）；遺傳信息處理（genetic information processing）；環境信息處理（environmental information processing)；細胞過程（cellular processes);生物體系統organismal systems)和人類疾?。╤uman diseases）。 PHF7互作蛋白共注釋出KEGG 通路118 條， 其中有統計學意義的通路（P＜0.05）27 條，其分布如圖11 所示。 結果表明，這些蛋白涉及代謝，遺傳信息處理，生物體系統和人類疾病4 個亞類， 富集基因較多的通路有代謝大類中的代謝通路（metabolic pathways），糖代謝（glycolysis）,氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）等，在遺傳信息的處理大類中涉及核糖體（ribosome）,在人類疾病中涉及帕金森病，阿爾茨海默癥和亨廷頓舞蹈病等。 可信度最高的十條富集通路根據P 值從小到大排列依次是 核 糖 體 （ribosome）， 丙 酮 酸 代 謝（pyruvate metabolism），大腸埃希菌感染（Pathogenic Escherichia coli infection），帕金森病（Parkinson’s disese），氧化磷酸化 （Oxidative phosphorylation）， 代 謝 通 路（metabolic pathways）, 亨廷頓病 （Huntington’s diaease）， 糖代謝（glycolysis），藥物代謝（drug metabolism），阿爾茨海默癥（Alzhemer’disease），繪制氣泡圖如圖12。 KEGG 結果表明，PHF7 在精子中的相互作用蛋白要參與了細胞代謝和遺傳信息處理的多種信號通路。

討 論

蛋白相互作用的研究是揭示蛋白作用機制的重要手段，之前的針對果蠅的研究中，我們對PHF7 在精子發生中的作用有了初步的了解。盡管PHF7 基因在不同物種之間的序列高度保守，但PHF7 在果蠅和哺乳動物中的位置及表達模式等差異很大， 哺乳動物和人類的生精過程調節機制也更為復雜，PHF7 在精子發生中的具體分子機制尚不清楚。 因此， 我們構建質粒并表達GST-PHF7 融合蛋白，通過體外實驗釣取其在人精子中的互作蛋白，并通過生物信息學方法分析其富集通路，為進一步研究PHF7 在精子發生中的作用機制提供探索方向和理論基礎。

GST pull-down 法和免疫共沉淀法是篩選細胞內與已知蛋白和位置蛋白相互作用的經典方法。 GST pull-down 法是將GST-PHF7 融合蛋白作為探針固定到凝膠柱上，與精子細胞總蛋白中的目的蛋白結合。 由于體外實驗不同于細胞內的生理環境， 部分蛋白可能會由于分子力或者電荷相互作用與融合蛋白結合； 部分蛋白雖能與PHF7 直接相互作用，但由于在精子細胞內的空間分布不同，生理環境下無法直接接觸，這些因素可能會造成假陽性[9]。 免疫共沉淀法可以分離得到天然狀態下相互作用的蛋白復合體， 這種蛋白復合體不一定是蛋白與蛋白之間的直接結合， 可能有其他蛋白在中間起橋梁作用使無關蛋白與其間接結合， 從而造成假陽性。 本研究同時進行了免疫共沉淀實驗和GST pull-down 實驗，經過考馬斯亮藍染色驗證，現有抗體無法在自然狀態下拉下PHF7 相互作用蛋白復合體，而GST pull-down 法則成功釣取PHF7 蛋白復合體， 故本研究使用GST pull-down 實驗產物進行質譜檢測和進一步分析。 本次共鑒定出75 個與PHF7 直接或間接相互作用蛋白， 其中大部分未被已知的STRING 蛋白相互作用數據庫收錄[10]。

圖11 PHF 互作蛋白在KEGG 數據庫中的富集通路

圖12 PHF 互作蛋白富集通路氣泡圖

GO 功能富集和KEGG 代謝通路注釋是蛋白質組學研究的重要方法，PHF7 的互作蛋白被顯著富集在數個功能和代謝通路中， 為進一步驗證其在精子發生中的功能提供了研究方向。 GO 富集分析的結果表明，PHF7 的互作蛋白在細胞組分上定位在從胞內細胞器、囊泡到細胞膜上， 涉及細胞器代謝和蛋白運輸等生物學過程，這和其在泛素-蛋白酶體系統中的定位是一致的[11]。 精子發生后期，圓形的單倍體精子細胞將經歷一系列的變形過程， 最終形成成熟精子。 精子形成過程中，組蛋白先被過渡核蛋白替代，然后又被魚精蛋白所取代。 其中一個關鍵的過程是組蛋白，過渡蛋白等關鍵蛋白的胞內定向運輸和降解。 這次注釋出的組蛋白及其變體，核糖體蛋白RPL，翻譯起始因子eIF，和熱休克蛋白HSP 家族等，均參與了精子發生過程中蛋白合成，運輸和代謝過程[12，13]。 這在一定程度上暗示了PHF7 及其互作蛋白可能的調節機制， 即在關鍵蛋白的裝配和運輸上發揮作用。 在分子功能上，PHF7 的互作蛋白注釋出了酶結合，蛋白結合和核酸結合的條目，這和其在表觀遺傳學層面調節精子發生的功能是相符合的[14，15]。在KEGG 的信號通路注釋中，PHF7 互作蛋白大多富集在各種代謝通路上，包括氧化磷酸化，丙酮酸代謝和糖代謝等， 這些關鍵蛋白的缺失均會影響生精功能[16，17]?？紤]到PHF7 的互作蛋白有約10%富集在線粒體代謝復合體和呼吸鏈上， 對精子細胞能量代謝的影響可能是其另一種作用機制。 同時我們發現，PHF7 基因敲除小鼠的精子活力明顯下降（數據未發表），PHF7 基因缺失影響了精子線粒體代謝是一種可能的解釋。 此外，KEGG 的結果提示部分蛋白（NDUFS7，UQCR，ATP5F等） 可能與神經系統疾病如帕金森病和阿爾茨海默癥等有關， 在這些神經系統疾病中這些基因的表達也表現出不同程度的相關性[18-20]。 考慮到PHF7 在腦組織中也有少量表達，而一些基因如DJ-1 也可同時涉及神經系統疾病和男性不育[21]，PHF7 及其互作蛋白在神經系統中也可能發揮一定的調節作用。 但由于本實驗存在著一定的假陽性可能， 富集在神經系統疾病通路的基因相比于背景基因也并不多，PHF7 及其互作蛋白是否能在神經系統中發揮作用仍待進一步的確認。