魚腥草揮發油抗氧化作用的研究

羅秋水 謝 升 湯凱潔 熊建華 杜 娟

(江西農業大學食品科學與工程學院，南昌 330045)

魚腥草(HouttuyniaecordataThunb)，又名紫蕺，野花麥，折耳根等，屬三白草科蕺菜屬，莖呈扁圓柱形，葉片卷折皺縮，搓碎有魚腥氣味，多分布于長江流域和南方省區[1]。魚腥草富含蛋白質、油脂、維生素等營養成分，還含有鈣、磷、錳、鈉、鉀等礦物素，同時具有能清熱解毒、消腫療瘡、利尿除濕、清熱止痢、健胃消食等功效。現代藥理實驗表明，具有抗菌、抗病毒、提高機體免疫力、利尿等作用，是國家衛生部確定為“既是食品，又是藥品”的資源之一[2]。

大量研究表明，藥食兩用的植物提取物均有不同程度的抗氧化作用[3]，而目前對魚腥草的研究更多集中于有效成分的提取和鑒定，對魚腥草揮發油的抗氧化作用研究及應用尚處于完善階段[4-6]。本實驗先選取了較為常用的DPPH·法和鄰二氮菲-Fe2+分光光度法來評定魚腥草揮發油的體外抗氧化活性，再以過氧化值為指標，采用Schaal烘箱法，評定魚腥草揮發油對五種食用油的抗氧化效果，旨在為魚腥草作為一種天然抗氧化劑及其綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

魚腥草：江西農業大學校園內；豬油、花生油、大豆油、菜籽油、葵花籽油：市售；抗壞血酸、草酸、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、H2O2、硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、重鉻酸鉀、碘化鉀、可溶性淀粉、冰乙酸、三氯甲烷均為分析純；SB-3200DTD超聲波清洗機；LD4-20 低速離心機；UV-9100 紫外可見分光光度計；RE-52A 型旋轉蒸發器；GZX-9246MBE電熱鼓風干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚腥草揮發油的制備

將魚腥草清除黃葉、洗凈，分離莖、葉，烘干粉碎后放入干燥器中備用。分別稱取一定量莖、葉樣品粉末，用70%的乙醇溶液按料液比1∶50對樣品進行水浴提取，提取時間為2 h、提取溫度為60 ℃，室溫下靜置10 min后，離心15 min，轉速4 000 r/min。過濾取上清液進行旋轉蒸發、濃縮，經乙醚和石油醚萃取后干燥，即得到魚腥草揮發油。

1.2.2 魚腥草揮發油不同濃度的配制

準確稱取0.25 g魚腥草揮發油，用無水乙醇定容至25 mL容量瓶中，得10 mg/mL魚腥草揮發油乙醇溶液，并以此為基準，用無水乙醇稀釋得到200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL魚腥草揮發油乙醇溶液濃度系列，保存備用。

1.2.3 抗壞血酸不同濃度的配制

準確稱取0.25 g抗壞血酸，分別用超純水及2%草酸溶液定容至25 mL容量瓶中，得10 mg/mL抗壞血酸水溶液及草酸溶液，并以此為基準，用超純水及2%草酸溶液稀釋得到200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL抗壞血酸水溶液及草酸溶液濃度系列，存于避光處備用。

1.2.4 對羥基自由基(·OH)的清除作用

準確稱取0.25 g鄰二氮菲，用無水乙醇定容至250 mL，得到5 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液；取0.19 g硫酸亞鐵晶體，蒸餾水定容至250 mL，得到5 mmol/L硫酸亞鐵溶液；取19 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4溶液和81 mL 0.2 mol/L的 Na2HPO4溶液，充分混合得到pH=7.4的0.2 mol/L磷酸緩沖溶液。

將配備好的魚腥草揮發油乙醇溶液、抗壞血酸水溶液系列溶液及相應試劑按表1依次添加，混勻后37 ℃水浴60 min，分別在536 nm處測吸光值，平行測定2次，結果取平均值，按公式計算清除率：

清除率=[A(樣)-A(損)/A(未)-A(損)]×100%

式中：A(損)為未添加樣品清除羥自由基所得損傷管的吸光值；A(未)為用蒸餾水代替損傷管中的雙氧水、未發生反應所得未損傷管的吸光值。

表1 羥基自由基實驗加樣表

1.2.5 對1,1-二苯基-2-苯基自由基(DPPH·)的清除作用

準確稱取DPPH·10 mg，用無水乙醇定容至100 mL容量瓶，得10% DPPH·無水乙醇溶液；再取10% DPPH·無水乙醇溶液5 mL，稀釋成1% DPPH·無水乙醇溶液，存于避光處備用。

將配備好的魚腥草揮發油乙醇溶液、抗壞血酸草酸溶液系列溶液及相應試劑按表2依次添加，反應10 min后分別于517 nm處測定吸光值。重復測定2次，結果取平均值，按公式計算自由基清除率：

清除率=[1-(Ai-Aj)/ (A-A0)] ×100%

表2 DPPH·實驗加樣表

1.2.6 油脂加速氧化實驗

采用Schaal烘箱法強制加速氧化[7]，將一定量的樣品、抗壞血酸或混合物加入50 g油樣混勻，置于100 mL燒杯中，敞口放入63 ℃的烘箱中恒溫保存，每12 h攪拌一次，并變換位置，每24 h測定一次各油樣的過氧化值，每個樣品平行測定2次，結果取平均值。

1.2.7 過氧化值的測定

過氧化值是常用來表示油脂被氧化程度的一種指標，過氧化值越大，說明油脂被氧化的程度越大。本實驗按GB 5009.227—2016測定過氧化值，用過氧化物相當于碘的質量分數表示過氧化值，基本操作：稱取試樣2～3 g，置于250 mL碘量瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，使試樣完全溶解，準確加入1.00 mL飽和碘化鉀溶液，塞緊瓶蓋，輕輕振搖0.5 min，在暗處放置3 min，取出，加100 mL水，搖勻后立即用硫代硫酸鈉標準溶液滴定析出的碘，滴定至淡黃色時，加1 mL淀粉指示劑，繼續滴定并振搖至溶液藍色消失為終點，同時進行空白實驗。

2 結果與分析

2.1魚腥草揮發油對羥基自由基的清除作用

鄰二氮菲-Fe2+水溶液中的Fe2+經Fenton反應：Fe2++H2O2→ Fe3++OH-+OH·可產生羥基自由基，而氮菲-Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，其536 nm處最大吸收峰消失，由此可通過比較536 nm處溶液吸光值的變化來反映對羥基自由基的清除作用[8]，清除率越大，說明清除自由基能力越強。

由圖1可知，魚腥草揮發油以及抗壞血酸對羥基自由基的清除作用均隨著質量濃度的增加逐漸增大，但抗壞血酸水溶液對羥基自由基的清除作用要優于魚腥草揮發油。當濃度在200～800 μg/mL范圍內，二者對羥基自由基清除作用均呈現劑量～效應關系，濃度越高，清除率越大，并接近線性相關。當質量濃度在800～1 200 μg/mL時，隨著濃度升高清除率依舊上升，但整體趨于平緩；在1 200 μg/mL時，抗壞血酸水溶液對羥基自由基清除率達到76.05%，魚腥草揮發油的清除率達到62.72%。

圖1 魚腥草揮發油對羥基自由基的清除作用

2.2 魚腥草揮發油對DPPH·的清除作用

DPPH·是一種穩定的有機自由基，其溶液具有特征的紫紅色團吸收峰，當存在自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數成定量關系，因而可用分光光度法進行定量分析[9]。

由圖2可知，質量濃度在200～1 200 μg/mL時，魚腥草揮發油對DPPH·的清除作用隨著質量濃度的增加逐漸增大；而抗壞血酸草酸溶液濃度在200～1 200 μg/mL范圍內時，清除率在92%上下浮動。由此可見，在1 200 μg/mL時，抗壞血酸草酸溶液對DPPH·的清除率達到93.86%，魚腥草揮發油的清除率達到72.43%。

圖2 魚腥草揮發油對DPPH·的清除作用

2.3 不同部位及混合魚腥草揮發油對大豆油的抗氧化作用

將油樣質量0.6%的莖部、葉部魚腥草揮發油分別加入大豆油中，進行氧化實驗，同時做空白對照，測定各油樣的過氧化值，結果如圖3所示。

圖3 不同部位及混合魚腥草揮發油對大豆油的抗氧化作用

由圖3可知，隨著實驗時間的增加，各實驗油樣的過氧化值均呈現增大趨勢；其中添加了混合魚腥草揮發油的油樣過氧化值最低，其次為葉部，然后是莖部，且都比空白樣品的低。由此可知，葉部魚腥草揮發油抗氧化效果要比莖部的好。

2.4 魚腥草揮發油對5種食用油的抗氧化作用

將油樣質量0.6%的魚腥草揮發油分別加入豬油、花生油、大豆油、葵花籽油和菜籽油中，進行氧化實驗，同時做空白對照，測定各油樣的過氧化值，結果表明各油樣隨著實驗時間的增加，其過氧化值均有一定程度增大，添加了魚腥草揮發油的油樣的過氧化值，均比空白油樣要低，說明魚腥草揮發油對5種食用油均具有一定抗氧化的作用；5種油樣在相同環境下的氧化速度有所不同，其中以豬油的氧化速度最慢，花生油的氧化速度最快。基于對大豆油的抗氧化效果相對明顯和穩定，后續實驗以大豆油作為對象進行研究。

2.5 不同劑量魚腥草揮發油對大豆油的抗氧化作用

將油樣質量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的魚腥草揮發油分別加入大豆油中，進行氧化實驗，同時做空白對照，測定各油樣的過氧化值，結果如圖4所示。

圖4 不同劑量魚腥草揮發油對大豆油的抗氧化作用

由圖4可知，隨著實驗時間的增加，添加了不同劑量魚腥草揮發油的油樣過氧化值呈現增大趨勢，且均比空白油樣要低；隨著魚腥草揮發油添加劑量的增大，相應油樣過氧化值減小，說明在以上劑量范圍內，魚腥草揮發油對大豆油的抗氧化作用具有劑量和效應關系，劑量越高，抗氧化效果越好。

2.6 魚腥草揮發油與抗壞血酸對大豆油的抗氧化作用

將油樣質量0.6%的魚腥草揮發油、抗壞血酸和兩者等比混合分別加入大豆油中，進行氧化實驗，做空白對照，測定各油樣的過氧化值，結果如圖5所示。

由圖5可知，隨著實驗時間的增加，各實驗油樣的過氧化值均呈現增大趨勢，添加抗壞血酸的油樣過氧化值比魚腥草揮發油的更低，抗壞血酸、魚腥草揮發油等比混合的最低；由此可知，抗壞血酸、魚腥草揮發油等比混合抗氧化效果最好，其次是抗壞血酸和魚腥草揮發油，可能的原因是抗壞血酸、魚腥草揮發油混合呈現協同增效作用，具有更好的抗氧化作用。

圖5 魚腥草揮發油與抗壞血酸對大豆油的抗氧化作用

3 結論

魚腥草揮發油在200～1 200 μg/mL質量濃度范圍內，隨著質量濃度的增加，對羥基和DPPH·兩種自由基的清除作用均有增強，其中魚腥草揮發油的質量濃度為1 200 μg/mL時，對羥基自由基清除率達到62.72%，對1,1-二苯基-2-苯基自由基清除率達到72.43%。魚腥草葉部揮發油對大豆油的抗氧化效果優于莖部；魚腥草揮發油對5種食用油均具有一定的抗氧化作用；5種油樣在相同環境下的氧化速度有所不同，其中以豬油的氧化速度最慢，花生油的氧化速度最快；在一定劑量范圍內，魚腥草揮發油對大豆油的抗氧化作用具有劑量～效應關系，劑量越高，抗氧化效果越好；魚腥草揮發油對大豆油的抗氧化作用弱于抗壞血酸，而兩者復配對大豆油的抗氧化性具有協同增效作用。綜上所述，魚腥草確實可以作為一種效果較好的天然抗氧化劑。