miRNA-638對巨噬細胞內膽固醇外流的影響及其發(fā)生機制研究

韓婕，高登峰，王曉娜，曹瑞華，鄧捷，葉平

生活方式、飲食結構等外部因素的改變與遺傳因素相互作用導致人體脂代謝紊亂，表現為總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及三酰甘油（TG）升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低，并可進一步導致脂代謝紊亂的相關性疾病的發(fā)生，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（ASCVD）等，加重醫(yī)療經濟負擔［1］。因此血脂管理是防治ASCVD的重要措施。脂質斑塊形成的中心環(huán)節(jié)是富含大量脂質的泡沫細胞沉積于血管內皮下［2］，其可通過攝取及外流膽固醇保持內外膽固醇穩(wěn)態(tài)。研究表明，肝臟既分泌了能夠負荷膽固醇的脂蛋白向外周運送膽固醇，也可通過高密度脂蛋白（HDL）轉運外周多余的膽固醇至肝臟進行代謝［3-4］。研究也證實了microRNA（miRNA）能夠參與調節(jié)膽固醇代謝的不同階段［5-9］。筆者前期從普通人群血漿中miRNA的差異性表達入手，通過芯片技術篩查發(fā)現miRNA-638與HDL-C水平相關［10］。目前關于miRNA-638的研究多集中在腫瘤方面［11-12］，其與膽固醇代謝的關系鮮有報道。本研究旨在探討miRNA-638對巨噬細胞內膽固醇外流的影響及其發(fā)生機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人髓系白血病單核細胞（THP-1）購自美國ATCC，編號TIB202；佛波酯（PMA）、NBD-膽固醇、3K15高速冷凍離心機購自美國Sigma公司；miRNA-638模擬物及其陰性對照物及HiPerFect Transfection Reagent購自德國Qiagen公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；總RNA經反轉錄試劑盒、SYBR Green qPCR試劑盒、引物、蛋白抽提試劑、Bradford蛋白定量試劑盒及辣根過氧化物酶標記二抗購自SinoGene公司；抗三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）/三磷酸腺苷結合盒轉運體G1（ABCG1）抗體購自美國Boster公司；抗極低密度脂蛋白受體（VLDLR）抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）及HDL購自北京協生生物科技有限責任公司；清道夫受體BI（SR-BI）抑制劑BLT-1購自美國Millipore公司；載脂蛋白AI（ApoAI）購自北京義翹神州科技有限公司；潔凈工作臺〔蘇凈安泰生產，型號：SW-CJ-2F（D）〕；倒置式生物顯微鏡（南京江南永新光學有限公司生產，型號：XD-101）；低速臺式大容量離心機（上海安亭科學儀器廠生產，型號：TDL-40B）；二氧化碳（CO2）細胞培養(yǎng)箱（Sanyo，型號：MCO-15AC）；JY-SPFT電泳槽、JY300C電泳儀、JY04S-3C凝膠成像系統購自北京君意東方電泳設備有限公司；生物分光光度計（Eppendorf，Biophotometer）；熒光實時定量PCR儀（ABI，StepOnePLUS），熒光酶標儀（BioTek，Synergy2）。

1.2 細胞培養(yǎng) 實驗完成于2016年9月—2017年9月。將THP-1以3×105cells/cm2的密度接種至24孔細胞培養(yǎng)板中，采用DMEM+10%胎牛血清（FBS）完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入PMA 100 ng/ml，置于37 ℃、5%CO2、95%相對濕度的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，誘導THP-1貼壁并分化為巨噬細胞。

1.3 轉染 miRNA-638模擬物為化學合成的雙鏈RNAs，在轉染到細胞后可模擬內源成熟miRNA-638，該實驗中miRNA-638模擬物為細胞培養(yǎng)級純度（＞90%純度）。miRNA-638模擬物陰性對照物為化學合成的經修飾的單鏈RNA，與任何已知的哺乳動物基因無同源性。轉染過程嚴格按照HiPerFect Transfection Reagent試劑盒說明書進行操作，具體方法如下：將干粉狀miRNA-638模擬物及其陰性對照物離心后，經高壓滅菌的雙蒸水配制成濃度為20 μmol/L的miRNA-638模擬物及其陰性對照物儲存液。根據預實驗結果，在DMEM培養(yǎng)基中按比例配制濃度為20 nmol/L的miRNA-638模擬物及其陰性對照物-HiPerFect Transfection Reagent復合物，輕輕震蕩混勻并于室溫下孵育10 min，后吸走24孔細胞培養(yǎng)板中巨噬細胞培養(yǎng)液，轉染12 h后，更換DMEM+10% FBS完全培養(yǎng)液，放入CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在轉染48 h后觀察細胞形態(tài)并收集細胞。

1.4 觀察指標

1.4.1 NBD-膽固醇外流率 轉染后在無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細胞8 h，更換100 μg/ml ox-LDL的DMEM+10% FBS完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入100 μmol/L BLT-1 2 h，在5 μmol/L的NBD-膽固醇孵育液孵育細胞4 h后，分別采用25 μg/ml ApoAI、50 μg/ml HDL和標準血清誘導外流液處理4 h，結束后收集誘導外流液及細胞裂解液。使用熒光酶標儀檢測誘導外流液和細胞裂解液的熒光強度，激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為469 nm和537 nm，計算NBD-膽固醇外流率即膽固醇外流率，NBD-膽固醇外流率=FI誘導外流液/（FI誘導外流液+FI細胞裂解液）×100%。

1.4.2 ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相對表達量 轉染后吸去舊培養(yǎng)液，加入經高壓滅菌的磷酸鹽緩沖液清洗細胞2～3次后吸干。加入適量TRIzol，用吸管反復吹打培養(yǎng)瓶壁，使巨噬細胞徹底脫離培養(yǎng)瓶壁后，將培養(yǎng)瓶內液體全部移入1.5 ml無RNA酶離心管中，劇烈震蕩，室溫靜置2～3 min，加入200 μl氯仿，劇烈渦旋30 s，室溫靜置5 min，4 ℃ 13 000×g離心15 min，留取無色上清液置于新的1.5 ml無RNA酶離心管中，加入等體積異丙醇混勻，冰上靜置10 min，4 ℃ 13 000×g離心10 min，棄上清液，加入1 ml 70%乙醇漂洗沉淀，4 ℃ 13 000×g離心5 min，棄70%乙醇，空氣晾干RNA沉淀，加60 μl 焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA沉淀。總RNA經反轉錄試劑盒合成cDNA，以β-actin為內參基因，采用實時熒光定量PCR法，經SYBR Green qPCR試劑盒分別檢測ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相對表達量，擴增條件：95 ℃預變性 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。反應結束后得到Ct值，根據公式2-ΔΔCt法計算目標基因相對表達量。各引物序列如下：β-actin上游引物：5'-ACTGCTCTGGCTCCTAGCAC-3'，下游引物：5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'；ABCA1上游引物：5'-AATTCTCAAGTGCAAACACTTCTGG-3'，下游引物：5'-GAGGCATATGCTTGCGGTACA-3'；ABCG1上游引物：5'-CTTGCAGTAGGGGCTTTCAG-3'，下游引物：5'-GCAAGGCTAGAGGTGTGGAG-3'；VLDLR上 游 引物：5'-TTCCAGTGCACAAATGGTCG-3'，下游引物：5'-GGAACACACTGGCCATTGTT-3'。

1.4.3 ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達量 采用Western blotting 檢 測 ABCA1、ABCG1、VLDLR 相 對表達量，具體如下：轉染后加入含蛋白酶抑制劑的蛋白抽提試劑提取細胞蛋白，采用Bradford蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，加入Loading buffer后煮沸蛋白并于-20 ℃保存。電泳分離蛋白：將封閉過的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜加入一抗，于4 ℃搖床孵育過夜，使抗原抗體充分結合；加入辣根過氧化物酶標記的二抗，采用化學發(fā)光法檢測ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達量。以β-actin為內參，將顯影結果進行灰度數據結果分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0及Prizm 5進行數據分析并作圖。計量資料以（± s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NBD-膽固醇外流率 轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞經ApoAI外流液介導的NBD-膽固醇外流率低于轉染陰性對照物巨噬細胞，差異有統計學意義（t=2.524，P＜0.05）；轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞與轉染陰性對照物巨噬細胞經HDL、標準血清外流液介導的NBD-膽固醇外流率比較，差異無統計學意義（t值分別為0.108、1.520，P值均＞0.05，見圖1）。

2.2 ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相對表達量 轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞的ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相對表達量低于轉染陰性對照物巨噬細胞，差異有統計學意義（t值分別為2.491、2.011、2.210，P值均＜0.05，見圖2）。

2.3 ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達量轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞中ABCA1、ABCG1相對表達量低于轉染陰性對照物巨噬細胞，差異有統計學意義（t值分別為2.663、2.145，P值均＜0.05）；轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞與轉染陰性對照物巨噬細胞中VLDLR相對表達量比較，差異無統計意義（t=1.005，P＞0.05，見圖3）。轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達量電泳圖見圖4。

3 討論

圖1 轉染miRNA-638模擬物及其陰性對照物巨噬細胞經ApoAI、HDL及標準血清外流液介導的NBD-膽固醇外流率Figure 1 NBD-cholesterol efflux rate by ApoAI，HDL and standard serum in macrophage transfected with miRNA-638 mimics and its negative control

圖2 轉染miRNA-638模擬物及其陰性對照物巨噬細胞中ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相對表達量Figure 2 Relative expression levels of ABCA1，ABCG1 and VLDLR mRNA in macrophages transfected with miRNA-638 mimics and its negative control

圖3 轉染miRNA-638模擬物及其陰性對照物巨噬細胞中ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達量Figure 3 Relative expression levels of ABCA1，ABCG1 and VLDLR proteins in macrophages transfected with miRNA-638 mimic and its negative control

圖4 轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達量的電泳圖Figure 4 Electrophoretogram of relative expressions of ABCA1，ABCG1 and VLDLR proteins in macrophages transfected with miRNA-638 mimic

膽固醇在構成細胞膜、合成膽汁酸及激素、參與機體內多種物質代謝等生理過程中發(fā)揮著重要作用［13］。目前研究認為，動脈粥樣硬化斑塊形成的核心是吞噬了大量膽固醇的泡沫細胞在血管內皮下沉積，而哺乳動物體內細胞大多不具備膽固醇的分解代謝能力［14］。因此，細胞內膽固醇的外流能夠有效防止膽固醇在外周組織器官中的蓄積。HDL能夠介導細胞內多余的膽固醇向肝臟轉運，經肝臟分解代謝后形成膽汁外排，從而維持機體內膽固醇穩(wěn)態(tài)，這一過程又被稱為膽固醇逆轉運（RCT）。RCT過程較復雜，目前研究認為，其主要依靠ABCA1/ABCG1、ApoAI、SR-BI等介導［15］。細胞內膽固醇通過細胞膜上ABCA1流出至循環(huán)中ApoAI，形成新生HDL顆粒，而新生HDL顆粒可繼續(xù)接受由ABCG1介導的膽固醇外流，直至形成成熟HDL顆粒，后被肝臟SR-BI選擇性攝取，最終將膽固醇分解代謝［16-20］，因此機體內RCT被認為是重要的抗動脈粥樣硬化斑塊形成的過程。前瞻性流行病學研究證實，HDL-C每升高1 mg/dl，ASCVD發(fā)病風險可降低2%～3%，并獨立于其他傳統心血管疾病的危險因素［21］。RCT中每一個步驟的效率均會影響整體過程［22-23］，而關鍵限速步驟為細胞內膽固醇外流［24］，其并不是依賴濃度梯度的簡單擴散，而是受到嚴格調控的膜轉運蛋白介導的主動耗能過程［25］。

雖然RCT的過程容易理解，但過程中每一個步驟的具體調控機制仍需進一步探索。現有的治療策略可能會導致較多不良反應［26-27］。目前研究發(fā)現，miRNA展現出了精確調節(jié)脂代謝的潛力，可能會成為減少不良反應的治療靶點［28］。筆者前期對普通人群循環(huán)miRNA篩查的結果提示，低HDL-C水平人群血漿中miRNA-638表達量高于正常HDL-C水平人群［10］。miRNA-638在人類及靈長類動物細胞中均有表達，而目前關于miRNA-638的研究多集中在腫瘤方面，提示其可能參與腫瘤細胞的增殖及轉移［11-12］。但miRNA-638與RCT的關系尚不明確。筆者前期發(fā)現為深入探討其在膽固醇代謝過程中可能發(fā)揮的作用提供了依據。

通過檢測細胞內膽固醇外流率可以明確miRNA-638對RCT過程有無影響。目前同位素氚標記的膽固醇（3H-膽固醇）是檢測膽固醇外流率的“金標準”，但因輻射污染問題無法廣泛應用。本研究采用NBD-膽固醇是將熒光基團標記于膽固醇烷基基團，而激發(fā)后的熒光強度與膽固醇水平呈正比［29］。本研究結果顯示，轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞經ApoAI外流液介導的NBD-膽固醇外流率低于轉染陰性對照物巨噬細胞；轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞與轉染陰性對照物巨噬細胞經HDL、標準血清外流液介導的NBD-膽固醇外流率間差異無統計學意義，可能是miRNA-638能夠影響細胞內膽固醇外流，且其調控具有選擇性，主要抑制細胞內膽固醇流出至ApoAI形成新生HDL顆粒過程。進一步研究結果表明，轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞中ABCA1、ABCG1相對表達量低于轉染陰性對照物的巨噬細胞；轉染miRNA-638模擬物巨噬細胞與轉染陰性對照物巨噬細胞中VLDLR相對表達量間差異無統計意義，提示miRNA-638能夠降低巨噬細胞中ABCA1、ABCG1 相對表達量，但對主要參與膽固醇攝取的VLDLR相對表達量無明顯影響。而生物信息學分析未能證實ABCA1及ABCG1基因調控序列中存在miRNA-638結合靶點［10］，筆者推測miRNA-638可能通過間接影響ABCA1、ABCG1的表達量從而發(fā)揮對RCT過程的調控作用。雖然ABCG1和ABCA1能夠協同介導細胞內膽固醇外流，但既往研究表明，高脂飲食喂養(yǎng)的外周巨噬細胞ABCG1特異性敲除LDL受體基因小鼠的動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生率僅從33%提高至36%，且斑塊大小與時間、ABCG1基因型密切相關，而外周巨噬細胞ABCA1特異性敲除LDL受體基因小鼠的動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生率可增長2倍，故ABCA1對動脈粥樣硬化斑塊的影響更為明顯［30］。

目前血脂管理指南將HDL-C視為評估ASCVD發(fā)生風險的重要指標，但因缺乏相關臨床證據支持，尚未將其作為主要的藥物干預靶點［21］。而關注HDL本身的功能及其相關的調控機制，尤其是HDL介導的RCT過程，或許比單純提高HDL-C更有意義。

綜上所述，miRNA-638可減少體外實驗中ApoAI介導的巨噬細胞內膽固醇外流，其可能是通過調控ABCA1/ABCG1表達實現的，而miRNA-638調控ABCA1/ABCG1表達的具體機制以及對體內RCT的影響仍需進一步研究。

作者貢獻：葉平進行文章的構思與設計，對文章整體負責、監(jiān)督管理；韓婕、高登峰、鄧捷進行研究的實施與可行性分析；韓婕進行數據收集，撰寫論文；韓婕、王曉娜進行數據整理；王曉娜進行統計學處理；韓婕、曹瑞華進行結果的分析與解釋；高登峰、鄧捷、葉平進行論文的修訂；高登峰、葉平負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。