咽炎消合劑對慢性咽炎大鼠模型咽粘膜TGF-β1、Smad3調節機制研究*

李在望，周家璇，黃春江，王 藝△

（1.暨南大學第二臨床醫學院/南方科技大學第一附屬醫院/深圳市人民醫院神經內科，廣東 深圳 518020；2.云南中醫藥大學第一臨床醫學院，云南 昆明 650021）

慢性咽炎為咽部粘膜，粘膜下及淋巴組織的慢性彌漫性炎癥，是上呼吸道慢性炎癥的一部分[1]。中醫稱為“慢喉痹”“虛火喉痹”等。以咽部不適、干燥、異物感、咽癢、刺激性咳嗽等癥狀為主要臨床特征，癥狀反復，病程較長，多見于成年人[2]。病因及發病機制復雜，無統一的治療方式，中藥治療具有一定優勢[3-4]。前期臨床研究表明，應用咽炎消合劑能夠減少動物咽粘膜組織慢性炎細胞的數量，減輕咽部血管通透性及炎細胞滲出，抑制纖維組織增生[2]。本研究通過對慢性咽炎大鼠模型的咽粘膜中轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和信號傳導蛋白Smad3 mRNA的表達情況進行分析，探討中藥復方咽炎消合劑對改善慢性咽炎癥狀和粘膜病理狀態的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠45只（北京維通利華實驗動物技術有限公司，0042625，SCXK（川）2019-0004），體質量180～220g，全價飼料適應喂養1周。

1.2 主要藥品、試劑和儀器 藥品：云南省中醫醫院院內中藥復方制劑咽炎消合劑（又名知石利咽合劑，批號 20190748）（組方：知母、石膏、法夏、厚樸、玄參、桔梗等）；試劑：TGF抗體、Smad3一抗（Santa Cruz公司）；5%氨水（Wabcan公司，批號 20190613）500mL瓶裝；Platinum?SYBR?Green qPCR試劑盒（Invitrogen公司）。儀器：喉頭噴霧器（金喉健噴霧劑10mL藥瓶）；透射電鏡及多用光學顯微鏡（JEOL公司JEM-1200EX），自制開口器，熒光定量PCR儀Light Cycler480（羅氏公司）等。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組 將45只SD大鼠隨機分組：空白對照組、標準慢性咽炎模型組、慢性咽炎標準模型治療組，共3組，每組15只。

1.3.2 造模及實驗方法 慢性咽炎標準模型造模方法：10%氨水用噴霧器噴大鼠咽腔2次，每次噴2撳，刺激時間間隔8 h，連續21 d。從第22天開始，停止上述操作，自然條件下飼養觀察[5-6]。

空白對照組：等量生理鹽水咽腔噴霧。

1.3.3 造模后給藥組治療 造模成功進行藥物干預。對照臨床成人用量計算咽炎消合劑大鼠灌胃的等效劑量，常溫下灌胃[6]。咽炎消合劑治療組（含生藥量2.0 g/mL），灌胃體積1 mL/100 g。空白治療組、慢性咽炎標準模型組用0.9%生理鹽水等體積灌胃[2]。治療干預15 d。

1.3.4 藥物治療干預后，開口器固定，取咽部粘膜組織做病理切片。HE染色，鏡下重點觀察粘膜上皮纖維結締組織、血管、腺體、上皮細胞、肌細胞。

1.3.5 qPCR檢測不同組別粘膜中的TGF-β1、Smad3 mRNA的表達情況。在熒光PCR擴增過程中，當擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數設定為Ct值；ΔCt內參基因的CT值歸一目標基因的CT值；ΔΔCt校準樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值；2-ΔΔCt表達量的比值。把所有組的樣品的 Ct值進行 t檢驗后，P＜0.5，按照 2-ΔΔCt方法計算真實性。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數據的統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用成組t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般觀察 對照空白組，模型組和治療組大鼠都出現間斷性喘鳴聲，騷動不安，飲水量明顯增加，側頭蹭墊料、搔抓口唇動作，少數個體出現了口唇局部潰破情況，皮毛粗糙、疏松、光澤度差。治療組進行咽炎消合劑給藥15 d后，大鼠的活動狀態趨于正常，飲水量較前減少，進食量明顯增加，皮毛光澤度有所改善等。開口器活體觀察咽部組織，見治療組大鼠口腔粘膜水腫情況減輕，點狀潰瘍面積和數量較模型組有明顯減少，咽部分泌物也有減少[2]。空白對照組體征無明顯變化。

2.2 咽粘膜病理切片觀察 對照空白組，模型組以及治療組的咽部組織出現了廣泛炎細胞浸潤情況，纖維上皮組織增生，局部有乳頭狀增生、釘突增生，并且出現有增生小血管擴增。治療組經咽炎消合劑干預治療后，咽黏膜上皮血管擴張基本消失，釘突增生減少，組織增生等病理表現情況對比治療前明顯改善，粘液腺增生數量減少，炎細胞浸潤也明顯減少。見圖1。

圖1 3組咽粘膜病理情況

2.3 大鼠咽部粘膜TGF-β1、Smad3 mRNA表達趨勢變化

標準慢性咽炎模型組、慢性咽炎模型治療組經過模型構建并評估成功后[2]，2組大鼠模型粘膜中的TGF-β1 mRNA的表達水平對照空白組具有顯著性差異（表 1，圖 2）。

圖2 造膜3周后TGF-β1表達情況

表1 模型構建后及藥物干預15d后大鼠咽部TGF-β1表達變化

咽炎消合劑對慢性咽炎模型治療組經過15d治療干預后，治療組大鼠模型粘膜中的TGF-β1 mRNA的表達水平明顯下降，與模型組對照具有顯著性差異（表2，圖 3）。

圖3 藥物干預15 d后各組大鼠TGF-β1表達情況

表2 模型構建后及藥物干預15d后各組大鼠咽部Smad3 mRNA表達趨勢變化

標準慢性咽炎模型組、慢性咽炎模型治療組成功建模后，2組大鼠模型粘膜中的Smad3 mRNA的表達水平升高，對照空白組具有顯著性差異；經過15d治療干預后，治療組大鼠粘膜中的Smad3 mRNA的表達水平對比模型組有了明顯下降，具有顯著性差異。

3 討論

慢性咽炎病程較長，纏綿難愈，與慢性炎癥刺激、長期煙酒過度，粉塵、有害氣體的刺激，胃食管反流性疾病，內分泌紊亂以及免疫功能紊亂等因素有直接的相關性[7-9]。而這些因素都導致了一個最主要病理改變：咽粘膜肥厚、咽后壁的淋巴濾泡增生，彌漫充血，雙側咽側索充血肥厚，即中醫所謂“痰凝血瘀，結聚咽喉”[10]。

研究結果顯示慢性咽炎模型中的治療組經咽炎消合劑干預治療后，大鼠一般攝食、飲水、活動狀況接近正常，檢查可見口腔粘膜水腫情況明顯緩解，點狀潰瘍面積和數量較模型組有明顯減少，咽部分泌物量也有降低。病理檢查顯示咽黏膜上皮血管擴張基本消失，釘突增生減少，組織增生等病理表現情況對比治療前明顯改善，粘液腺增生數量減少，炎細胞浸潤也明顯減少。說明咽炎消合劑能夠減少咽粘膜組織慢性炎細胞的數量，減輕咽部血管通透性及炎細胞滲出，抑制纖維組織增生，對慢性咽炎的癥狀和體征有明顯的治療作用[11-13]。這一治療作用過程推測與TGF-β1/Smads信號轉導通路有密切相關性[14]。

本實驗研究結果顯示：TGF-β1、Smad3 mRNA水平在大鼠咽部粘膜樣本中，治療組、模型組與空白組對比有明顯的統計學差異。說明氨水對大鼠咽部粘膜的刺激形成的炎癥反應，激發特異性炎癥介質、各種細胞因子的釋放，形成了氧化應激反應等，最終導致組織器官細胞的炎性增生和上皮、間充質細胞的纖維化，而組織的纖維化最公認的最重要的通路就是TGF-β1/Smads信號轉導通路[15-16]。TGF-β1 是屬于一組調節細胞生長和分化的TGF-β超家族。TGF-β1對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節作用，可以抑制免疫活性細胞的增殖，促進成纖維細胞，促進傷口愈合和典型肉芽組織形成[17]。TGF-β1／Smads信號轉導通路中，TGF-β1的表達水平直接決定了下游Smads的表達，其相關效應是通過該信號轉導通路發揮的，而其中調控Smad3蛋白可以阻斷TGF-β1信號的繼續傳導[18]。

在慢性咽炎中，TGF-β1、Smad3的表達可能與咽粘膜的損傷修復可能具有一定關系[19]。以往研究顯示，不同病理觸發因素導致的3種主要粘膜上皮增生狀態：上皮-間質轉化，衰老和內質網應激以及未反應的蛋白質反應，每種上皮狀態都有其特征性的轉錄驅動因子，所有這些狀態都引起分泌反應，這些反應具有促進膠原蛋白積累的能力[20]。TGF-β1可誘導十幾種蛋白的表達，這是膠原蛋白大量表達和組織積累所必需的。這些蛋白質幾乎在膠原蛋白加工的每個階段都起作用[21]。如上所述，TGF-β1是成纖維細胞活化和膠原蛋白分泌的主要驅動力[15]。本次實驗研究結果顯示，TGF-β1、Smad3 mRNA表達水平在大鼠咽部粘膜樣本中，治療組均低于模型組，并且相對于模型組，咽炎消合劑治療組粘液腺無明顯腫大，釘狀突增生減少，血管輕度擴張，說明咽炎消合劑對慢性咽炎大鼠模型的咽部粘膜組織增生等病理表現情況對比治療前明顯改善，炎細胞浸潤也明顯減少，說明對病理性增生可逆轉和修復作用[22]。同時也可推測該藥對TGF-β1/Smads信號轉導通路可能具有調控作用，其作用可能與其抑制TGF-β1、Smad3 mRNA的過度表達，從而控制TGF-β1/Smads信號通路的過度激活而緩解咽部粘膜纖維病理性增生的病變進程有關，這為中醫藥臨床應用防治慢性咽炎提供了實驗依據[23-25]。

綜上所述，通過對慢性咽炎大鼠模型造模和藥物干預不同階段咽粘膜TGF-β1、Smad3 mRNA表達趨勢變化的分析，說明咽炎消合劑對慢性咽炎大鼠模型TGF-β1/Smads信號通路具有調控作用，通過阻斷該信號通路干預了咽粘膜的組織纖維增生及炎性改變，證實了該藥物對慢性咽炎治療的有效性，從而為進一步探索慢性咽炎發病因素和中藥治療機制提供理論依據。