天麻乙醇提取物輔助降血脂保健功能評價*

孫 航，代 蓉，寧 瓏，何芳雁

（云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

世界衛(wèi)生組織2017年的數(shù)據(jù)顯示，2015年全球因心血管病死亡的人數(shù)約1 770萬，占全球死亡人數(shù)的31%，預(yù)計到2030年，因心血管病死亡的人數(shù)將會達到2 360萬[1-2]。我國國家心血管病中心發(fā)布的《中國心血管病報告2018》也指出，我國心血管病患病人數(shù)達2.9億，位于城鄉(xiāng)居民致死性疾病的首位，其農(nóng)村、城市死亡率分別為45.50%、43.16%，且呈逐年上升趨勢[3]。高脂血癥是心血管病的主要誘因之一[4-5]，因此對高脂血癥人群進行早期干預(yù)以預(yù)防心血管事件的發(fā)生具有重要意義。

《本草綱目》記載：天麻，性味甘平，入肝經(jīng)，有息風(fēng)、定驚、肢益氣力、補五勞七傷通血脈的作用。天麻為云南道地藥材，2018年國家衛(wèi)生健康委員會將其納入藥食同源目錄。現(xiàn)有文獻報道，天麻細粉能有效調(diào)控糖脂代謝，具有顯著的降血脂作用，提示天麻在降血脂方面具有作為保健品開發(fā)的潛在價值[6-7]。由于天麻中含有大量淀粉，僅以天麻打粉后單用，或作為原料組成復(fù)方，可能會減弱天麻的藥效[8]。本實驗采用70%的食用乙醇提取，制備天麻提取物，參照2003年版《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[9]，通過高脂飲食誘導(dǎo)復(fù)制大鼠高脂血癥模型，檢測血脂4項及肝組織病理損傷情況，以評價天麻提取物輔助降血脂的功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠300只，清潔級，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半。由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，批號43004700019312。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)環(huán)境要求溫度18～24℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥物與試劑 云南昭通彝良小草壩天麻，以70%食用乙醇提取的方法制備得到天麻提取物；辛伐他汀片（山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限公司，批號：20141204）；甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所（批號分別為：20170726、20170809、20170718、20170819、20171007、20171124）；高脂飼料（77.8%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+10%豬油+10%蛋黃粉+0.2%膽鹽）委托昆明市艾尼莫實驗動物養(yǎng)殖中心制作，生產(chǎn)許可證為SCXK（滇）K2012-0003。

酶標儀（Infinite M2000 PRO）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S24）；分析天平（XS125A）；低溫高速離心機（cf16RXΠ）。

1.3 實驗方法

1.3.1 給藥劑量 參照2003年版《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》，做功能性篩選的動物實驗劑量一般不高于人體推薦量的2/3，不低于人體推薦量的1/3，且其中一個劑量應(yīng)相當于人體推薦攝入量（折算為每公斤體重的劑量）的5倍（大鼠）或10倍（小鼠），且最高劑量不得超過人體推薦攝入量的30倍（特殊情況除外），受試樣品的功能實驗劑量必須在毒理學(xué)評價確定的安全劑量范圍內(nèi)。故本實驗設(shè)置大鼠高劑量組為人體推薦量的25倍，即1.425 g生藥/kg（1 g提取物/kg），低劑量組為人體推薦量的5倍，即0.285 g生藥/kg（0.2 g 提取物/kg）。

1.3.2 動物分組及給藥 將大鼠隨機分為5組，即正常組（等體積蒸餾水）、模型組（等體積蒸餾水）、陽性藥（辛伐他汀，4 mg/kg）、天麻提取物高劑量組（天麻提取物，1 g/kg）、天麻低劑量組（天麻提取物，0.2 g/kg），各組動物以1 mL/100 g灌胃體積連續(xù)灌胃120 d，每天灌胃1次。除正常組外，其他各組均通過飼喂高脂飼料建立高脂血癥模型，連續(xù)飼養(yǎng)120 d，每隔30 d通過眼底靜脈叢取血1.5 mL，4 000 r/min離心10 min取血清，測定各組動物血脂4項（TG、TC、HDL-C、LDL-C）的含量，以評價高脂血癥模型復(fù)制情況，直至模型復(fù)制成功1周后處死動物進行指標檢測。

1.3.3 血脂4項及ALT、AST水平檢測 給藥前1 d將大鼠禁食12 h后，腹主動脈取血6 mL，靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液分別測定動物血脂四項及血清ALT、AST水平。充分研磨新鮮肝左葉用于制備10%肝勻漿，4 000 r/min離心10 min后，取上清液測肝勻漿中ALT、AST水平；肝右葉用于組織病理學(xué)觀察。

1.3.4 肝組織病理損傷情況 迅速剝離大鼠肝臟，在冰生理鹽水中沖洗后，濾紙上拭干水分，對其進行拍照，觀察各組大鼠肝臟外觀變化。分取右葉肝組織，將大鼠肝右葉置于4%多聚甲醛溶液中，4℃冰箱中固定過夜。次日取厚度不大于5 mm的組織塊放入鏤空鋁盒中，以流動水浸泡2 h以上。依次梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸泡石蠟。石蠟包埋固定，3 h后做連續(xù)切片，切片厚度為5 μm。將切片置于59～62℃烤箱內(nèi)烘烤20 min，進行切片，常規(guī)脫蠟復(fù)水。復(fù)水后的組織經(jīng)蘇木染色5 min，流動水沖洗15 min，鹽酸酒精分化后，流動水沖洗10 min，伊紅染色10 s，經(jīng)梯度酒精脫水，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 大鼠心肌及腎功能指標檢測 給藥前1 d將大鼠禁食12 h后，腹主動脈取血6 mL，靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液分別測定肌酐（Cr）含量和肌酸激酶（CK）水平。

2 結(jié)果

2.1 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠血脂4項的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中TC、LDL-C水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組可降低大鼠血清中TC、LDL-C水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；天麻提取物高劑量組能降低大鼠血清中TC、LDL-C水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；天麻提取物低劑量組僅降低大鼠血清中LDL-C 水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝功能的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清及肝臟ALT、AST水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)合表1血脂四項結(jié)果，表明大鼠高脂血癥模型復(fù)制成功。與模型組比較，辛伐他汀組能降低大鼠血清中TC、LDL-C水平以及肝組織ALT、AST水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；天麻組均能降低肝組織中ALT、AST水平（P＜0.05）。天麻高劑量組能降低血清AST水平（P＜0.05），見表2。

表1 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠血脂4項的影響（±s，n=15，mol·L-1）

表1 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠血脂4項的影響（±s，n=15，mol·L-1）

注：與正常組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05。

組別劑量/（g·kg-1）TCTGLDL-CHDL-C正常組 - 2.94±1.04 1.02±0.30 1.32±0.37 2.01±0.54模型組 - 4.95±2.90▲ 1.31±0.58 2.95±0.94▲ 1.80±0.56辛伐他汀組 0.004 3.99±1.48★ 1.02±0.48 1.58±0.87★ 1.24±0.45高劑量組 1 3.62±1.39★ 1.30±0.89 1.24±0.53★ 1.55±0.43低劑量組 0.2 5.21±2.64 1.31±0.82 1.76±0.68★ 1.29±0.46

表2 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝功能的影響（±s，n=15，U·L-1）

表2 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝功能的影響（±s，n=15，U·L-1）

注：與正常組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05。

組別劑量/（g·kg-1）肝臟ALT肝臟AST血清ALT血清AST正常組 - 42.93±33.75 21.88±6.36 4.53±3.22 10.55±3.07模型組 - 161.90±42.10▲ 44.44±23.48▲ 9.27±6.95▲ 21.42±11.32▲辛伐他汀組 0.004 68.32±35.28★ 37.55±20.49★ 9.55±7.81 18.10±9.88高劑量組 1 53.93±36.92★ 23.54±7.09★ 6.58±3.88 11.35±3.42★低劑量組 0.2 50.73±27.11★ 39.61±24.11★ 10.02±5.32 16.36±7.07

2.3 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理損傷的影響

2.3.1 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病變程度的影響 正常組大鼠肝臟大小正常，顏色暗紅，邊緣銳利，質(zhì)地光滑柔軟；而模型組大鼠可見肝臟明顯腫大，顏色發(fā)黃，邊緣較鈍，表面飽滿光滑，切面有油膩感。天麻提取物高、低劑量組肝組織病變程度均較模型組有不同程度的改善，見圖1。

圖1 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病變程度的影響

2.3.2 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理學(xué)變化的影響 正常組：肝組織結(jié)構(gòu)整齊且完整，中央靜脈大小均一，中央靜脈周圍的肝細胞呈放射狀排列，細胞質(zhì)豐富、均勻，細胞核中央排列。

模型組：肝組織結(jié)構(gòu)呈不規(guī)則形狀，中央靜脈異常擴大，中央靜脈周圍存在脂肪空泡，細胞核偏向一側(cè)。這表明高脂飼料喂養(yǎng)已成功建立SD大鼠高脂血癥模型。

辛伐他汀組：肝組織結(jié)構(gòu)基本整齊且完整，大多數(shù)中央靜脈大小均一，中央靜脈周圍的肝細胞呈放射狀排列，細胞質(zhì)豐富、均勻，細胞核基本中央排列。

天麻提取物組：天麻提取物高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)呈不規(guī)則形狀，中央靜脈略微擴大，中央靜脈周圍存在少量脂肪空泡細胞，少量細胞核偏向一側(cè)；天麻提取物低劑量組肝組織結(jié)構(gòu)呈不規(guī)則形狀，中央靜脈基本大小均一，中央靜脈周圍存在明顯脂肪空泡細胞，少量細胞核偏向一側(cè)，見圖2。

圖2 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理變化的影響（×200）

2.3.3 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理切片NAS積分評價 與正常組比較，模型組NAS積分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組和天麻提取物高劑量組NAS積分均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理切片NAS積分的比較（±s，n=15，分）

表3 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理切片NAS積分的比較（±s，n=15，分）

注：與正常組比，▲P＜0.05；與模型組比，★P＜0.05。

脂肪變（0～3） 小葉內(nèi)炎癥（0～3） 氣球樣變（0～2）組別N A S積分0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2正常組 7 0 0 0 5 2 0 0 6 0 1 0.7 1±0.7 6模型組 0 0 1 5 3 0 2 1 0 2 4 5.6 7±1.6▲辛伐他汀組 2 0 2 3 6 1 0 0 6 0 1 3.8 6±1.2 1★高劑量組 0 4 1 2 5 2 0 0 0 1 6 3.8 6±0.9 0★低劑量組 0 1 1 4 5 1 0 0 0 1 5 4.5 0±0.8 4

3 討論

高脂血癥是指血液中TG、TC、LDL-C的含量過高，HDL-C含量過低的一種全身性脂代謝異常疾病[10]。高脂飲食可導(dǎo)致脂肪在肝細胞內(nèi)堆積，使肝臟產(chǎn)生脂肪泡，形成脂肪肝，影響肝臟的脂質(zhì)代謝，進而引起血脂水平升高[11-12]。天麻含有天麻素、天麻苷元、天麻多糖、生物堿等多種復(fù)雜成分，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降壓、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)天麻細粉、天麻素及天麻酸性多糖可改善糖脂代謝紊亂，發(fā)揮降脂作用[14-17]。但天麻中含大量淀粉，僅靠打粉很難使其有效成分溶出，且成分單一，療效有限[8]。課題組前期參照2015版《中國藥典》“第三部通則0512技術(shù)要求”，對云南昭通3個產(chǎn)地（彝良小草壩、鎮(zhèn)雄鹽源、威信水田）的天麻，按藥典要求的質(zhì)控成分進行含量測定。結(jié)果表明，彝良小草壩天麻的醇提率最高，且其藥典質(zhì)控成分含量最高；另有文獻報道，采用70%乙醇進行提取，天麻提取物的得率最高，且天麻素提取更完全[18]。因此，本實驗采用70%的食用乙醇提取，制備彝良小草壩天麻提取物，符合保健品要求。

本研究通過喂養(yǎng)高脂飼料誘導(dǎo)SD大鼠建立高脂血癥模型，建模成功后在2003年版《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》“輔助降血脂功能功效學(xué)評價實驗的要求”的指導(dǎo)下，除檢查血脂四項及肝組織病變情況常用指標外，增加檢測血清、肝臟ALT、AST水平。ALT、AST主要存在于肝細胞中，是肝細胞損傷的敏感標志。當肝細胞受損時，肝細胞膜通透性增高，肝細胞內(nèi)的ALT、AST釋放入血，血清ALT、AST水平急劇升高[19-21]，故檢測血中ALT、AST的含量或水平可快速判斷出肝功能是否正常。實驗結(jié)果顯示，天麻提取物高劑量組可顯著降低血清中TC、LDL-C及血清AST、肝臟ALT、AST的水平，并能顯著減輕肝損傷。根據(jù)以上指標綜合分析，天麻提取物具有輔助降血脂功能。

課題組前期開展了天麻藥材粉的毒理學(xué)評價（包括急性毒性實驗、遺傳毒性實驗、傳統(tǒng)致畸實驗、短期喂養(yǎng)實驗）均未發(fā)現(xiàn)受試物產(chǎn)生相關(guān)毒性，提示長期常規(guī)劑量下使用天麻提取物是安全的。

雖然模型組指標有明顯的變化，但部分指標不具有統(tǒng)計學(xué)意義。例如模型組大鼠血清中TG、HDL-C雖分別有升高及降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。分析原因可能為本實驗周期較長，大鼠易產(chǎn)生厭食，導(dǎo)致模型組動物個體產(chǎn)生較大差異。其次，大鼠肝臟內(nèi)LDL受體途徑對飲食中的固醇類具有抵抗力，可能導(dǎo)致其對高膽固醇食物不敏感[22]。大鼠還可通過減少自身肝臟合成膽固醇、增加膽汁酸生成等途徑來保持血漿脂蛋白穩(wěn)定[22]。針對“厭食”情況已有文獻報道，可以采用高脂-普通飲食交替飼養(yǎng)的方法，但目前本課題組暫未進行具體結(jié)果的驗證，未來將對合理有效的建立高脂血癥模型進行深入研究。