補腎化痰方對絕經后骨質疏松模型大鼠骨重建平衡的影響

周亞娜 周廣文 張麟 張妍 譚張奎 李章青 黃詩怡 熊夢欣 向楠

[摘要] 目的 觀察補腎化痰方對絕經后骨質疏松（PMOP）模型大鼠骨重建平衡的影響。 方法 選取6月齡SD雌性大鼠30只，按照隨機數字表法將其分為假手術組、模型組及中藥組，每組10只。假手術組及中藥組均以卵巢切除術造模，假手術組僅切除卵巢旁等量脂肪。術后5周開始灌胃，中藥組給予補腎化痰方，假手術組和模型組灌服等量生理鹽水。12周末大鼠處死后取材，分別采用酶聯免疫吸附測定法、蛋白質印跡法及免疫組化法檢測血清及骨組織骨形態發生蛋白2（BMP2）、Runt相關轉錄因子2（RUNX2）、骨保護素（OPG）、核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的含量及定位，采用micro CT檢測大鼠的骨密度，比較分析各組間各個指標的差異。 結果 模型組和中藥組大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均低于假手術組，RANKL含量高于假手術組，差異有統計學意義（P < 0.05）。中藥組大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均高于模型組，RANKL含量低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。模型組和中藥組大鼠骨組織BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均低于假手術組，RANKL灰度值高于假手術組，差異有統計學意義（P < 0.05）。中藥組大鼠骨組織BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均高于模型組，RANKL灰度值低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。免疫組化結果顯示，BMP2、RUNX2、OPG的陽性表達主要位于骨髓基質細胞胞漿及骨小梁周邊成骨細胞中;RANKL的陽性表達位于骨質邊緣破骨細胞中，呈棕黃色顆粒。 結論 補腎化痰方能夠通過BMP2/Smad/RUNX2信號通路及OPG/RANKL/RANK信號通路調控骨重建平衡，從而起到治療PMOP的作用。

[關鍵詞] 補腎化痰方;骨組織骨形態發生蛋白2/Smad/Runt相關轉錄因子2;骨保護素/核因子κB受體活化因子配體/核因子κB受體活化因子;絕經后骨質疏松

[中圖分類號] R-332 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（b）-0008-05

Effect of Bushen Huatan Decoction on bone remodeling balance in ovariectomized osteoporosis rats

ZHOU Ya′na1* ? ZHOU Guangwen2* ? ZHANG Lin3 ? ZHANG Yan4 ? TAN Zhangkui4 ? LI Zhangqing4 ? HUANG Shiyi4 ? XIONG Mengxin4 ? XIANG Nan4

1.Department of Oncology， Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan ? 430061， China; 2.College of Acupuncture and Bone Injury， Hubei University of Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan ? 430065， China; 3.Department of Osteoarticular Surgery， Wuhan Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine ?Wuhan NO.1 Hospital， Hubei Province， Wuhan ? 430061， China; 4.the First Clinical College， Hubei University of Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan ? 430065， China

[Abstract] Objective To study the effect of Bushen Huatan Decoction on bone remodeling balance in ovariectomized osteoporosis rats. Methods Thirty-six month old female SD rats were divided into three groups： sham operation group， model group and traditional Chinese medicine group according to the random number table method， with 10 rats in each group. In sham operation group and traditional Chinese medicine group， the model was made by ovariectomy. In sham operation group， only the same amount of fat was removed. 5 weeks after operation， rats in traditional Chinese medicine group were given Bushen Huatan Decoction， and rats in sham operation group and model group were given the same amount of normal saline. 12 weeks after rats were killed， the content and localization of bone morphogenetic protein 2 （BMP2）， runt related transcription factor 2 （RUNX2）， osteoprotegerin （OPG）， nuclear factor kappa B receptor activating factor ligand （RANKL） in serum and bone tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay， Western blot and immunohistochemistry respectively. Bone mineral density of rats was measured by micro CT， and the differences of each index between each group were analyzed. Results Bone mineral density and serum BMP2， RUNX2， OPG and OPG/RANKL contents of model group and traditional Chinese medicine group were lower than those of sham operation group， and RANKL content was higher than that of sham operation group， with statistically significant differences （P < 0.05）. Bone mineral density and serum BMP2， RUNX2， OPG， OPG/RANKL content of the rats in traditional Chinese medicine group were higher than those in model group， and RANKL content was lower than that in model group， with statistically significant difference （P < 0.05）. BMP2， RUNX2， OPG and OPG/RANKL gray values of bone tissue in model group and traditional Chinese medicine group were lower than those in sham operation group， and the RANKL gray values were higher than those in sham operation group （P < 0.05）. BMP2， RUNX2， OPG and OPG/RANKL gray values of bone tissue in traditional Chinese medicine group were higher than those in model group， and RANKL gray values were lower than those in model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The results of immunohistochemistry showed that the positive expression of BMP2， RUNX2 and OPG was mainly located in the cytoplasm of bone marrow stromal cells and osteoblasts around the trabecula; the positive expression of RANKL was located in osteoclasts at the border of bone， which were brownish yellow granules. Conclusion Bushen Huatan Decoction can regulate bone remodeling balance through BMP2/Smad/RUNX2 signal pathway and OPG/RANKL/RANK signal pathway to treat postmenopausal osteoporosis.

[Key words] Bushen Huatan Decoction; BMP2/Smad/RUNX2; OPG/RANKL/RANK; Postmenopausal osteoporosis

絕經后骨質疏松（PMOP）是全身代謝性骨病，以骨量減少、骨微結構破壞、骨脆性增加、易發骨折為特征，致殘率和致死率高，嚴重威脅中老年婦女的健康[1]。現代研究表明，PMOP的發生與骨形成[成骨細胞（OB）介導]和骨吸收[破骨細胞（OC）介導]之間動態失衡密切相關。調控骨組織骨形態發生蛋白2（BMP2）/Smad/Runt相關轉錄因子2（RUNX2）信號通路會影響OB的分化及骨細胞外基質合成與分泌，能夠促進骨的形成及增加骨的含量[2];而在骨吸收和骨形成的偶聯中，骨保護素（OPG）/核因子κB受體活化因子配體（RANKL）/核因子κB受體活化因子（RANK）信號通路起關鍵作用[3]。中醫藥防治PMOP是我國獨具特色和優勢的治療方式，在改善患者臨床癥狀方面療效顯著[4]。湖北名師向楠教授基于痰濁在骨質疏松癥發病中的作用，結合《本草綱目》補骨脂丸與《丹溪心法》黃瓜蔞丸加減而成補腎化痰方[5-6]。在臨床中，向楠教授以此方為基礎方，辨證論治PMOP，取得了良好的臨床效果，并對其作用機制進行了一系列研究[7-9]。本研究旨在探討補腎化痰方對PMOP大鼠骨重建平衡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，6月齡，雌性，體重250～350 g，共30只，由華中科技大學同濟醫學院提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0018，實驗動物合格證號：42000600017470。飼養于湖北中醫藥大學實驗動物中心，溫度18～25℃，濕度45%～55%，保證飼料飲水充足。實驗由湖北中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會審查通過。

1.2 藥物與試劑

補腎化痰方由淫羊藿、補骨脂、菟絲子、全瓜蔞、紅曲、山楂構成（含量分別為10、15、30、15、12、20 g）;湖北省中醫院門診部藥房提供研究用生藥，并由實驗研究人員加水煎煮濃縮，于4℃冰箱貯存備用。試劑：大鼠OPG試劑盒（貨號：JYM0510Ra）、RANKL試劑盒（貨號：JYM0391Ra）、BMP2試劑盒（貨號：JYM0665Ra）、RUNX2試劑盒（貨號：JYM0899Ra）均由武漢基因美生物科技有限公司提供;OPG抗體（貨號：Ab73400）、BMP2抗體（貨號：Ab14933）、大鼠RUNX2抗體（貨號：Ab23981m）均購自Abcam;RANKL抗體（貨號：Sc-7628，Snata）。

1.3 儀器與設備

uCT50（SCANCO MEDICAL，瑞士）;MK3酶標儀（Lab systems Multi-skan MS公司，芬蘭）;Tanon-5200全自動化學發光分析儀（上海天能公司）;RM2235石蠟切片機（徠卡顯微系統有限公司）。

1.4 實驗動物分組與給藥

適應性喂養大鼠，1周后腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下俯臥固定，背側正中切口后按照隨機數字表法分組處理。假手術組僅切除卵巢周圍與雙側卵巢重量等同的脂肪組織，而不摘除卵巢;模型組與中藥組均行卵巢切除術建立PMOP大鼠模型，在腎下極附近尋找到卵巢后用4號線結扎并雙側摘除，分層縫合切口。造模術后5周，開始給藥;假手術組和模型組均灌胃1 mL/100 g的生理鹽水，中藥組以0.94 g/mL灌胃補腎化痰方，1次/d，持續8周。

1.5 血清BMP2、RUNX2、OPG、RANKL檢測

12周末，大鼠眼球取血，肝素抗凝，30 min內3000 r/min（離心半徑為8 cm）離心，取上清，保存于 -20℃冰箱備用。采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）參照試劑盒說明檢測血清BMP2、RUNX2、OPG、RANKL含量。

1.6 骨組織BMP2、RUNX2、OPG、RANKL蛋白檢測

12周末，大鼠處死后，取右側股骨洗凈。取部分骨片研磨、提取蛋白，蛋白質印跡法檢測骨組織BMP2、RUNX2、OPG、RANKL蛋白的表達，其余部分放入4%多聚甲醛固定液中固定、脫鈣，免疫組化檢測BMP2、RUNX2、OPG、RANKL定位。

1.7 骨密度及骨微結構檢測

取大鼠左側的股骨放在micro CT載物臺上固定。以360°掃描角度、15 μm的掃描分辨率，沿大鼠股骨長軸方向，對股骨近干骺段，進行X線掃描，以獲取到連續、平面的μ-CT圖像。掃描完成后，選取生長板遠端骨組織作為松質骨感興趣區域，將最低閾值設為170，來進行股骨的三維重組，并提取圖像信息，最后用自帶軟件進行定量分析。

1.8 統計學方法

數據分析用SPSS 19.0統計軟件。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般觀察

大鼠于麻醉后3～4 h全部蘇醒，進食正常，活動正常，切口均無紅腫、感染征象。1周后，切口愈合。灌胃時模型組和中藥組分別有1只和2只大鼠死亡。

2.2 各組大鼠骨密度及血清相關指標比較

模型組和中藥組大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均低于假手術組，RANKL含量高于假手術組，差異有統計學意義（P < 0.05）。中藥組大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均高于模型組，RANKL含量低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠骨組織相關指標比較

模型組和中藥組大鼠骨組織BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均低于假手術組，RANKL灰度值高于假手術組，差異有統計學意義（P < 0.05）。中藥組大鼠骨組織BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均高于模型組，RANKL灰度值低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2、圖1。

免疫組化結果顯示，BMP2、RUNX2、OPG的陽性表達主要位于骨髓基質細胞胞漿及骨小梁周邊OB中（圖2～4，封四）;RANKL的陽性表達位于骨質邊緣OC中，呈棕黃色顆粒（圖5，封四）。

3 討論

傳統中醫并無PMOP的病名，而根據對其證候群的描述，醫學界基本認同感PMOP應歸屬于“骨痿”“骨空”的范疇;而基于中醫基礎理論“腎主骨生髓”，目前臨床多“從腎論治”PMOP[10-11]。現代研究發現，PMOP的發病與脂代謝紊亂具有緊密的相關性[12]，而多項研究指出，“痰濁”的物質基礎很可能是脂質代謝紊亂[13]。基于此種認識，向楠教授提出PMOP的治療應從痰論[14]，并將補腎化痰方作為其臨床治療PMOP的基礎方。方中淫羊藿與補骨脂合用，同為君藥，發揮益腎壯陽、強筋健骨的作用;菟絲子滋補肝腎、固精縮尿，全瓜蔞清熱化痰，兩藥相須同為臣藥;山楂善于消食化積、行氣散瘀，紅曲長于健脾消食、活血化瘀，共為佐藥。諸藥相合，發揮補腎益髓、化痰調脂的作用。

骨骼是具有持續重塑周期特性，正常骨代謝包括骨形成和骨吸收，兩者是一對偶聯關系，其動態的平衡對維持骨質及骨量至關重要。現代研究發現，多個參與骨代謝相關調控的信號通路，相互交叉，通過激活或抑制一些關鍵環節的細胞因子，調節OB或OC功能，進而影響骨質疏松的發病[15]。其中，BMP2/Smad/RUNX2信號轉導及OPG/RANKL/RANK信號傳導系統在維持骨重建平衡方面發揮重要作用。大量基礎試驗研究證實，調控BMP2/Smad/RUNX2信號通路能夠促骨形成并增加骨量[2]。這與本研究發現基本一致，與假手術組比較，去勢骨質疏松大鼠血清及骨組織BMP2、RUNX2含量明顯降低，表明去勢大鼠的骨形成能力下降。淫羊藿的主要活性成分是淫羊藿苷，補骨脂素是補骨脂的主要有效成分，而研究發現，淫羊藿苷、補骨脂素配伍能夠通過調控BMP2及Smad1、4誘導BMSCs成骨分化，促進骨形成[16]。因此，補腎化痰方中的補腎中藥可能通過提高大鼠血清及骨組織BMP2、RUNX2含量，調控BMP2/Smad/RUNX2信號轉導通路，發揮促進骨形成的作用。

在巨噬細胞集落刺激因子影響下，RANK與特異性結合配體RANKL并啟動細胞內信號傳導，促進OC的增殖、分化與成熟。而OB和骨髓間充質干細胞分泌的OPG作為RANKL的假性受體，比膜受體RANK的結合能力強，可以競爭性結合RANKL，阻止RANKL與RANK之間的相互作用，從而抑制OC的分化與活性，抑制骨重吸收過程[17]。本研究也顯示，與假手術組比較，PMOP大鼠血清及骨組織OPG含量均明顯下降，而RANKL含量明顯升高，且OPG/RANKL比值變化具有顯著差異，提示OPG/RANKL/RANK信號通路的激活與骨質疏松的發病密切有關。研究指出，淫羊藿苷、淫羊藿總黃酮可以不同程度降低RANKL的表達，提高OPG基因表達，從而發揮促骨形成作用[18];補骨脂提取物也可通過上調OPG、下調RANKL表達提高地塞米松誘導骨質疏松癥大鼠的骨密度，改善其骨生物力學[19]。菟絲子黃酮也能夠調節去卵巢大鼠OPG、RANKL的水平，從而增加骨密度，改善骨質疏松癥狀[20]。而紅曲能夠通過上調OPG mRNA表達和蛋白表達，抑制RANK表達，影響OPG/RANKL/RANK通路，抑制OC分化成熟，減緩PMOP的發病[21-22]。可見，補腎化痰方可通過補腎、化痰多種中藥的綜合作用，提高骨組織OPG含量及OPG/RANKL比值，降低RANKL水平，發揮抑制骨吸收的作用。

綜上所述，補腎化痰方可以通過調控BMP2/Smad/RUNX2信號通路及OPG/RANKL/RANK信號通路，在促進骨形成的同時，抑制骨吸收，通過恢復骨重建的平衡，發揮抗骨質疏松癥的作用。

[參考文獻]

[1] ?中華醫學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會.原發性骨質疏松癥診療指南（2017）[J].中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志，2017，10（5）：413-444.

[2] ?於紹龍，劉丹平.成骨因子BMP-2/Smads/Runx2信號轉導通路[J].遼寧醫學院學報，2014，35（5）：94-96.

[3] ?李盛村，鮑捷，王靜，等.骨保護素/核因子-κB受體活化因子配體/核因子-κB受體活化因子信號通路與骨質疏松的研究進展[J].中國康復理論與實踐，2014，20（3）：250-252.

[4] ?謝平金，柴生颋.中醫藥治療絕經后骨質疏松癥研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2018，20（3）：144-148.

[5] ?明·李時珍.增補本草綱目[M].北京：中國醫藥科技出版社，2016：385，507.

[6] ?元·朱丹溪.丹溪心法[M].北京：中國醫藥科技出版社，2018：63.

[7] ?周亞娜，向楠，陳輝.補腎化痰法影響骨髓間充質干細胞成骨分化的實驗研究[J].中國中醫基礎醫學雜志，2015， 21（3）：275-277.

[8] ?周廣文，向楠，周亞娜，等.補腎化痰方對去勢骨質疏松大鼠鈣沉積的影響[J].中國骨質疏松雜志，2018，24（3）：366-370.

[9] ?周廣文，向楠，張妍，等.高通量測序研究補腎化痰方對去勢骨質疏松大鼠腸道菌群結構與多樣性的影響[J].中華中醫藥雜志，2019，34（7）：3305-3310.

[10] ?李建國，謝興文，李寧，等.絕經后骨質疏松癥的中醫臟腑認識及治療現狀[J].中國中醫基礎醫學雜志，2019， 25（3）：410-412，420.

[11] ?鄧昶，周明旺，付志斌.骨質疏松癥的中醫病因病機及其治療進展[J].中國骨質疏松雜志，2017，23（8）：1105-1111.

[12] ?張冰雨，曾瑞翔，雷濤.脂代謝與骨代謝相關機制的研究進展[J].中國骨質疏松雜志，2015，21（10）：1263-1266.

[13] ?李維娜，馮玲，隋歌川.從痰濁論治高脂血癥研究進展[J].山東中醫雜志，2017，36（5）：430-433.

[14] ?周亞娜，向楠.從“痰”論治骨質疏松癥[J].湖北中醫雜志，2013，35（12）：36-38.

[15] ?閆慧明，郭靜，安燕，等.分子信號通路在骨質疏松癥發生機制中的研究進展[J].中國骨質疏松雜志，2016，22（10）：1336-1340.

[16] ?高璐，鄭洪新，陳誼敬，等.淫羊藿苷、補骨脂素、齊墩果酸、二苯乙烯苷正交配伍調控Bmp2、Smad1、4誘導BMSCs成骨分化的影響[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2014，16（5）：1094-1102.

[17] ?李雪，周延民，馬珊珊，等.RANK-RANKL-OPG 信號通路在骨重建中的分子作用機制[J].口腔醫學研究，2016， 32（6）：659-662.

[18] ?宋敏，羅曉，李寧，等.淫羊藿總黃酮含藥血清對成骨細胞OPG/OPGL基因表達的影響[J].時珍國醫國藥，2012， 23（4）：883-886.

[19] ?周倚墨，張建寧，單中書.補骨脂提取物干預骨質疏松模型大鼠骨密度及骨生物力學的變化[J].中國組織工程研究，2020，24（2）：165-170.

[20] ?趙素霞，劉會麗，江紅.菟絲子黃酮通過調節Wnt/β-catenin信號通路干預去卵巢大鼠骨代謝的機制研究[J].臨床和實驗醫學雜志，2018，17（1）：25-28.

[21] ?沈家峰，盧建華，徐孝平，等.紅曲對去卵巢大鼠骨組織RANKL、OPG蛋白和mRNA表達的影響[J].中華中醫藥雜志，2018，33（4）：1370-1372.

[22] ?盧建華，盧燁超，金紅婷，等.紅曲對去卵巢大鼠骨質疏松模型血清ALP，TRAP及骨組織TNF-α，RANK表達的影響[J].中國中醫骨傷科雜志，2017，25（9）：5-8.

（收稿日期：2019-08-29 ?本文編輯：李亞聰）