肺結核感染患者外周血miR-155表達與CD8+T細胞分化的關系

魏連存

[摘要] 目的 探討肺結核感染患者外周血單個核細胞（PBMC）中微小RNA-155（miR-155）表達與CD8+T細胞分化的關系。 方法 選取2017年1月～2019年6月青海省第四人民醫院收治88例肺結核感染患者進行研究，其中活動性肺結核42例（活動組），潛伏結核感染者46例（潛伏組），同期體檢健康者50名作為對照組。觀察三組PBMC中miR-155、T細胞亞群及CD8+T細胞中γ-干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-4（IL-4）、IFN-γ/IL-4表達情況，分析不同miR-155表達患者IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平及相關性。 結果 活動組、潛伏組PBMC miR-155、CD3+CD8+、IFN-γ、IL-4表達量高于對照組，活動組高于潛伏組（P < 0.05）;活動組IFN-γ/IL-4比值高于對照組（P < 0.05）;活動組、潛伏組PBMC CD3+CD4+細胞比例、CD4+/CD8+比值低于對照組，活動組低于潛伏組（P < 0.05）;miR-155高表達組IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值高于miR-155低表達組（P < 0.05）;PBMC miR-155表達與IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值呈正相關（r = 0.695，P = 0.000;r = 0.477，P = 0.000;r = 0.446，P = 0.000）。 結論 肺結核患者PBMC miR-155高表達，誘導CD8+T細胞活化，并誘導其向細胞毒性T細胞1表型分化。

[關鍵詞] 肺結核;微小RNA-155;CD8+T細胞;分化;相關性

[中圖分類號] R521 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（b）-0120-04

The relationship between the expression of miR-155 in peripheral blood and the differentiation of CD8+T cells in patients with pulmonary tuberculosis

WEI Liancun

Department of Laboratory， the Fourth People′s Hospital of Qinghai Province， Qinghai Province， Xi′ning ? 810000， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the expression of microRNA-155 （miR-155） in peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and the differentiation of CD8+T cells in patients with pulmonary tuberculosis. Methods A total of 88 patients with pulmonary tuberculosis infection who admitted to the Fourth People′s Hospital of Qinghai Province from January 2017 to June 2019. Among them， 42 cases were active pulmonary tuberculosis （active group）， 46 cases were latent tuberculosis infection （latent group）， and 50 cases were healthy during the same period as control group. The expressions of miR-155， T lymphocyte subsets in PBMC and interferon-γ （IFN-γ）， interleukin-4 （IL-4） and IFN-γ/IL-4 in three groups were observed， the levels of IFN-γ， IL-4 and IFN-γ/IL-4 in CD8+T cells of patients with different miR-155 expression were analyzed. Results The expressions of miR-155， CD3+CD8+， IFN-γ and IL-4 in PBMC of the active group and latent group were higher than those of the control group， and the activity group was higher than the latent group （P < 0.05）， the IFN-γ/IL-4 ratio in the active group was higher than that in the control group （P < 0.05）. The percentage of PBMC CD3+CD4+ cells and CD4+/CD8+ ratio in active group and latent group were lower than those in control group， and the active group were lower than those in latent group （P < 0.05）. The ratios of IFN-γ， IL-4 and IFN-γ/IL-4 in the high expression group of miR-155 was higher than that of the low expression group of miR-155 （P < 0.05）. The expression of PBMC miR-155 was positively correlated with IFN-γ， IL-4 and IFN-γ/IL-4 ratio （r = 0.695， P = 0.000; r = 0.477， P = 0.000; r = 0.446， P = 0.000）. Conclusion PBMC miR-155 is highly expressed in patients with pulmonary tuberculosis， which induces activation of CD8+T cells and differentiation into cytotoxic T ceu 1 phenotype.

[Key words] Tuberculosis; MicroRNA-155; CD8+T cells; Differentiation; Correlation

肺結核是結核分枝桿菌感染肺部所致的一種慢性傳染病，與感染菌株數量、性狀及患者自身免疫功能相關[1-2]。患者多伴免疫功能異常，而CD8+T細胞及其分泌的細胞因子在細胞免疫中發揮重要作用[3]。而微小RNA（microRNA，miRNA）在機體穩態調節中發揮重要作用，與心血管疾病、傳染病及惡性腫瘤等疾病的發生、發展緊密相關[4-5]。miR-155在結核分枝桿菌感染患者血漿中異常表達，可作為肺結核診斷標志物[6]。因此，本研究旨在探討肺結核感染患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中miR-155表達與CD8+T細胞分化的關系，為其臨床治療及分子機制研究提供臨床資料支持。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2017年1月～2019年6月青海省第四人民醫院（以下簡稱“我院”）收治88例肺結核感染患者作為研究對象，其中活動性肺結核42例（活動組），體檢檢查呈潛伏結核感染者46例（潛伏組），同期體檢健康者50名作為對照組。納入標準：①符合肺結核診斷標準[7];②潛伏感染者為QFT診斷試劑盒檢測陽性，而無臨床癥狀者;③年齡>18歲;④研究對象知情，簽署知情同意書;⑤經我院醫學倫理委員會批準。排除標準：①復治肺結核者;②近6個月有免疫制劑使用史;③伴免疫缺陷性疾病者;④伴內分泌性疾病者;⑤合并惡性腫瘤者;⑥合并乙肝、丙肝者;⑦入組前有抗結核治療史者。活動組男23例，女19例;年齡21～65歲，平均（45.92±6.58）歲。潛伏組男26例，女20例;年齡22～63歲，平均（44.27±6.82）歲。對照組男27例，女23例;年齡19～64歲，平均（45.18±6.39）歲。三組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 PBMC制備

取受試者早晨空腹靜脈血10 mL，置于肝素鈉抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離、純化PBMC。

1.3方法

miR-155檢測，采用實時熒光定量PCR檢測PBMC miR-155表達量，應用miRNeasy Mini RNA試劑盒（QIAGEN，德國，生產批號：20181022）提取PBMC中總RNA，采用Reverse Transcription System試劑盒（Applied Biosystems，美國，生產批號：00963671）逆轉錄為cDNA，以U6為內參，應用SYBR Green PCR Master Kit試劑盒（Applied Biosystems，美國，生產批號：20180824）進行PCR擴增，采用2-△△CT方法計算miR-155相對表達量，miR-155引物序列，正向引物5′-3′：GGAGGTTAATGCTAATCGTGATAG，反向引物5′-3′：GTGCAGGGTCCGAGGT;U6引物序列，正向引物5′-3′：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，反向引物5′-3′：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。

PBMC T細胞亞群檢測，采用流式細胞術檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞及CD8+T細胞內γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4），將PBMC置于流式管中，分別加入CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE，4℃避光染色30 min，流式細胞儀（BD，美國）待檢，加入固定液固定，再加破膜液，加IFN-γ-PE-Cy5、IL-4-V450，避光反應45 min，洗滌細胞，磷酸鹽緩沖液重懸，上流式細胞術檢測。

1.4統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料行正態性檢驗，符合正態分布，以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法;采用Pearson相關性分析miR-155與IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4表達的關系。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1三組PBMC miR-155表達

PBMC miR-155表達量活動組（2.95±0.73）高于潛伏組（1.06±0.32）、對照組（0.49±0.14），潛伏組高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.2 三組PBMC T細胞亞群變化

活動組、潛伏組PBMC CD3+CD4+細胞比例、CD4+/CD8+比值低于對照組，活動組低于潛伏組（P < 0.05）;潛伏組、活動組CD3+CD8+細胞比值高于對照組，活動組高于潛伏組（P < 0.05）。見表1。

表1 ? 三組PBMC T細胞亞群變化（%，x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05;與潛伏組比較，#P < 0.05。PBMC：外周血單個核細胞

2.3 三組CD8+T細胞中IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4表達量比較

活動組、潛伏組CD8+T細胞中IFN-γ、IL-4表達量高于對照組，活動組高于潛伏組（P < 0.05）;活動組IFN-γ/IL-4比值高于對照組（P < 0.05），活動組與潛伏組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

表2 ? 三組CD8+T細胞中IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4表達（x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05;與潛伏組比較，#P < 0.05。IFN-γ：γ-干擾素;IL-4：白細胞介素-4

2.4 不同PBMC miR-155表達患者IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4表達

以肺結核患者PBMC miR-155表達中位數為界值，分為低表達組（n = 41）與miR-155高表達組（n = 47）。miR-155高表達組IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值明顯高于miR-155低表達組（P < 0.05）。見表3。

表3 ? 不同PBMC miR-155表達患者IFN-γ、IL-4、

IFN-γ/IL-4表達（x±s）

注：IFN-γ：γ-干擾素;IL-4：白細胞介素-4

2.5 肺結核患者PBMC miR-155與IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4表達相關性

肺結核患者PBMC miR-155表達與IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值均呈正相關（r = 0.695，P = 0.000;r = 0.477，P = 0.000;r = 0.446，P = 0.000）。見圖1～3。

IFN-γ：γ-干擾素

圖1 ? 肺結核患者PBMC miR-155與IFN-γ表達相關性

3 討論

miRNA可作為肺結核潛伏感染的高價值生物標志物，在肺結核發病機制中發揮重要作用[8]。Lou等[9]研究顯示，miR-223在結核分枝桿菌感染的小鼠肺組織、脾臟組織中高表達，參與肺基質降解。顏保松等[10]研究證實，miR-101、miR-223、miR-424聯合檢測對肺結核有較高診斷效能。miR-155具有調節腫瘤細胞增殖、分化等作用，還參與免疫炎性反應、微生物感染等過程，結核分枝桿菌能誘導miR-155表達，miR-155過表達能降低Atg3蛋白表達，促進自噬過程[11]。本研究結果發現，與對照組比較，活動組、潛伏組PBMC miR-155表達量升高，活動組高于潛伏組，與楊紹俊等[12]的結果相似，提示肺結核感染患者PBMC miR-155高表達，可能參與其發生發展。T淋巴細胞根據細胞表型不同可分為CD4+T細胞與CD8+T細胞，介導細胞免疫炎性反應[13-14]。結果顯示活動組、潛伏組患者PBMC CD3+CD4+細胞比例、CD4+/CD8+比值低于對照組，活動組低于潛伏組，CD3+CD8+細胞比例高于對照組，活動組高于潛伏組，與劉寧等[15]的結果相似，提示肺結核患者存在細胞免疫功能異常現象。在結核分枝桿菌感染時，IFN-γ能活化單核細胞，可強化感染的巨噬細胞的吞噬作用，還有助于體內細菌清除，而IL-4是細胞毒性T細胞（Tc）1亞群的調節因子，還能誘導Tc2分化及輔助性B細胞產生抗體[16-18]。本研究結果顯示，活動組、潛伏組患者IFN-γ、IL-4表達顯著高于對照組，活動組高于潛伏組，活動組患者IFN-γ/IL-4比值高于對照組，與王赟等[19]的研究結果相似，提示肺結核患者存在Tc1/Tc2失衡現象，并向Tc1偏移。而活動組與潛伏組患者IFN-γ/IL-4比值差異無統計學意義（P > 0.05），可能是由樣本量較少所致。miR-155可促進CD8+T細胞增殖及其細胞免疫應答，而miR-155缺乏，CD8+T細胞增殖受到抑制，T細胞分泌IFN-γ能力減弱[20]。此外，miR-155高表達組患者CD8+T細胞中IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值高于miR-155低表達組，提示在肺結核患者PBMC miR-155表達與CD8+T細胞的分化相關。可能是miR-155過表達可激活IFN-γ相關信號通路，促進CD8+T細胞向Tc1分化。研究顯示，肺結核患者PBMC miR-155表達與IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值呈正相關，提示miR-155與IFN-γ、IL-4可能通過某種信號通路協同參與肺結核發生發展。

綜上所述，肺結核患者PBMC miR-155高表達，促進CD8+T細胞活化，與IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值呈正相關，并誘導CD8+T細胞向Tc1表型轉化。

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（收稿日期：2019-09-17 ?本文編輯：劉永巧）