廣藿香酮對腦卒中大鼠的影響及其作用機制

古長維，劉仲，武苗苗，辛紅娟，黨曉燕

腦卒中是由于腦血流減少或供氧不足導致腦組織死亡的急性腦血管疾病，可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中指動脈粥樣硬化或血栓阻塞血管致使腦部血液供應中斷；出血性腦卒中指血管破裂致使血液滲入大腦，進而破壞腦組織［1］。腦卒中具有高發病率、高致殘率、高病死率及高復發率的特點［2-3］，其中缺血性腦卒中發病率約占腦卒中患病人數的60%～70%。目前臨床上關于腦卒中尚缺乏有效的治療方法，常以預防為主［4］。廣藿香提取物廣藿香酮（POG）具有抗癌、抗炎、抗菌等多重藥理作用［5-6］，常用于心血管疾病、糖尿病、肝炎等多種疾病的預防［7］，且其在前列腺癌、白血病和膽囊癌等惡性腫瘤中具有明顯的抗腫瘤作用［8-10］。相關研究表明，POG可通過抑制機體Livin蛋白表達、激活B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）而促進線粒體細胞色素C釋放，進而活化半胱氨酸天冬酶3（caspase-3），導致DU145細胞凋亡，而細胞凋亡基因如Bcl-2、caspase-3等與高血壓密切相關［11］。既往關于POG治療腦卒中的報道較少。本研究旨在探討POG對腦卒中大鼠的影響及其作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗于2018年12月—2019年4月完成。選取7～8周齡SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體質量150～170 g，由西安交通大學動物研究中心提供（許可證號：SCXK新2018-0076）。大鼠均在西安交通大學動物房SPF級適應性飼養1周，動物房溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，人工光照、陰暗各12 h，整個實驗過程中大鼠均可自由進食和飲水。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

1.2.1 主要藥物 POG（四川省維克奇生物科技有限公司生產，CAS號：23800-56-8，純度≥98%），水合氯醛（成都德思特生物技術有限公司生產）。

1.2.2 主要試劑 超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（上海一研生物科技有限公司生產），丙二醛（MDA）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司生產），一氧化氮（NO）試劑盒（上海嵐派生物科技有限公司生產），聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）凝膠配制試劑盒（西安赫特生物科技有限公司生產），TRIzol試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司生產），Rabbit anti-Bcl-2（Sino Biolgical），Rabbit anti-VEGF（Sino Biolgical），Rabbit anti-Bax（Sino Biolgical），Rabbit anti-GAPDH（Sino Biolgical），LY294002（德國達姆施塔特默克公司生產），反轉錄-定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）試劑盒（Thermo Fisher Scientific生產）。

1.2.3 主要儀器 光學顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司生產），高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific生產），低溫離心機（湖南凱達科學儀器有限公司生產），微量分光光度儀（梅特勒-托利多國際有限公司生產），化學發光儀（Bio-Rad公司生產）。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模 采用線栓法阻斷大鼠大腦中動脈血流以制備腦卒中模型，具體方法如下：大鼠經10%水合氯醛進行腹腔麻醉后仰臥固定于平板上，給予碘伏消毒，于大鼠頸部正中做一切口，而后分離頸部右側皮下組織和腺體，沿右側胸鎖乳突肌腱向下探尋頸動脈并對頸總動脈近端、遠端頸外動脈進行結扎，在其頸總動脈分叉部或頸外動脈殘端插入直徑為0.26 mm的魚線并以插入約18 mm直至有阻塞感為宜，再采用血管夾夾閉頸內動脈近端；最后在頸部切口縫合前結扎頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈分叉處，固定閉合線［12］。大鼠禁食12 h。

1.3.2 分組 將36只大鼠隨機分為空白對照組（未經模型誘導，n=6）、對照組（建模后未經治療，n=6）、低劑量組（建模24 h后給予POG 5 mg/kg，n=6）、中劑量組（建模24 h后給予POG 15 mg/kg，n=6）、高劑量組（建模24 h后給予POG 45 mg/kg，n=6）和LY294002組（建模24 h后給予0.1%～0.3%二甲亞砜溶解至濃度為0.1%，n=6）。

1.4 觀察指標

1.4.1 磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化AKT（p-AKT）、磷酸化內皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白相對表達量 采用Western blot法檢測六組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對表達量，具體操作如下：按照SDSPAGE凝膠配制試劑盒說明書配置凝膠，確保六組大鼠蛋白樣量相同；根據marker標志切割目的蛋白所在區域凝膠，將濃縮膠轉固相載體如聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后孵育p-PI3K、p-AKT、p-eNOS第一抗體并置于4 ℃冰箱中過夜，次日孵育第二抗體1 h，再次洗膜并將PVDF膜置入化學發光儀的暗盒中顯示蛋白條帶，以目的基因蛋白條帶的灰度值與內參基因GAPDH的灰度值比值為目的蛋白相對表達量。

1.4.2 Bcl-2、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、血管內皮生長因子（VEGF）蛋白及其mRNA相對表達量 分別采用Westren blot法、RT-qPCR方法檢測Bcl-2、Bax、VEGF蛋白、mRNA相對表達量，Westren blot法具體操作與上述一致，RT-qPCR方法具體如下：首先，按照TRIzol試劑盒說明書提取大鼠組織總RNA并采用2-ΔΔCq方法進行定量；其次，按照RT-qPCR試劑盒說明書配置25 μl的反應體系（包括10 μl Total RNA，2.5 μl 10×DNaseI Buffer，20 U RNase Inhibitor，1 μl RNase-free，11 μl DEPC處理水）將RNA合成cDNA，取cDNA；再配置25 μl的總PCR反應體系（包括 17.5 μl ddH2O，2.5 10×buffer，2 μl dNTP，0.2 μl Taq DNA聚 合 酶，1 μl Forward primer，1 μl Reverse primer）擴增cDNA，按照95 ℃初始變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s的程序反應進行40個循環，根據循環閾值計算Bcl-2、Bax、VEGF的mRNA相對表達量?；蛞镄蛄幸姳?。

1.4.3 SOD、MDA、NO水平 分別采用SOD試劑盒、MDA ELISA試劑盒、NO試劑盒檢測六組大鼠大腦皮質和外周血SOD、MDA及NO水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

表1 Bcl-2、Bax、VEGF引物序列Table 1 Primer sequences of Bcl-2，Bax and VEGF

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0（International Business Machines Corporation，IBM）統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對表達量 六組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中高劑量組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對表達量低于對照組，p-AKT和p-eNOS蛋白相對表達量高于LY294002組，差異有統計學意義（P＜0.05，表2）。

表2 六組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對表達量比較（±s，μg/ml）Table 2 Comparison of relative protein expression quantity of p-PI3K，p-AKT and p-eNOS in the six groups

表2 六組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對表達量比較（±s，μg/ml）Table 2 Comparison of relative protein expression quantity of p-PI3K，p-AKT and p-eNOS in the six groups

注：p-PI3K=磷酸化PI3K，AKT=磷酸化AKT，p-eNOS=磷酸化內皮型一氧化氮合酶；與對照組比較，aP＜0.05；與高劑量組比較，bP＜0.05

組別 只數 p-P13K p-AKT p-eNOS空白對照組 6 0.19±0.01 0.20±0.01 0.18±0.01對照組 6 0.79±0.02 0.77±0.02 0.71±0.03低劑量組 6 0.57±0.01 0.59±0.01 0.59±0.01中劑量組 6 0.54±0.01 0.49±0.01 0.39±0.01高劑量組 6 0.36±0.02a 0.38±0.02a 0.38±0.02a LY294002 組 6 0.39±0.02 0.27±0.01b 0.23±0.01b F值 4.03 3.23 4.68 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 Bcl-2、Bax、VEGF蛋白及其mRNA相對表達量六組大鼠Bcl-2、Bax、VEGF蛋白及mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中高劑量組大鼠Bcl-2蛋白相對表達量高于對照組，Bax、VEGF蛋白相對表達量低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；高劑量組大鼠Bcl-2、VEGF mRNA相對表達量高于對照組，Bax mRNA相對表達量低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.3 大腦皮質和外周血NO、MDA、SOD水平 六組大鼠大腦皮質和外周血NO、MDA、SOD水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中高劑量組大鼠大腦皮質和外周血NO、SOD水平高于對照組，大腦皮質和外周血MDA水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；高劑量組大鼠大腦皮質和外周血MDA水平高于LY294002組，大腦皮質和外周血SOD水平低于LY294002組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

3 討論

PI3K是一種由趨化因子受體激活的信號傳導酶［13］。既往研究表明，PI3K能與C5a受體結合形成激動劑而激活多種信號蛋白［14］。PI3K抑制劑蟲草素與LY294002均可抑制趨化劑誘導的巨噬細胞的趨化性［15-16］，其中PI3K活化主要與靠近其質膜內側底物有關。多種生長因子和信號轉導復合物如成纖維細胞生長因子（FGF）、VEGF、人生長因子（HGF）、血管生成素1（Ang1）和胰島素等均能激活PI3K，也可通過激活受體酪氨酸激酶（RTK）引起自磷酸化［17］。PI3K激活導致第二信使質膜內磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）產生，該蛋白可與信號蛋白AKT和磷酸肌醇依賴激酶1（PDK-1）結合，進而誘導AKT中Ser308磷酸化，激活AKT［18］。AKT激活IκB激酶（IKKα）可降解NF-κB的抑制劑IκB，從而使NF-κB從細胞質中釋放出來進行核轉位，通過激活其靶基因而提高細胞存活率［19］。本研究結果顯示，高劑量組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對表達量低于對照組，p-AKT和p-eNOS蛋白相對表達量高于LY294002組，提示POG、LY294002均可使腦卒中大鼠PI3K/AKT信號通路受到抑制，究其原因可能為高劑量POG的作用方式與LY294002相似，均可抑制PI3K、AKT磷酸化。

表3 六組大鼠Bcl-2、Bax、VEGF蛋白及其mRNA相對表達量比較（±s，μg/ml）Table 3 Comparison of relative protein and mRNA expression quantity of Bcl-2，Bax and VEGF in the six groups

注：與對照組比較，aP＜0.05

組別 只數 蛋白相對表達量 mRNA相對表達量Bcl-2 Bax VEGF Bcl-2 Bax VEGF空白對照組 6 0.40±0.01 0.08±0.02 0.07±0.01 0.036±0.001 0.001±0.000 0.017±0.003對照組 6 0.01±0.01 0.80±0.01 0.36±0.02 0.005±0.002 0.004±0.001 0.003±0.001低劑量組 6 0.11±0.02 0.69±0.02 0.34±0.01 0.006±0.002 0.003±0.001 0.004±0.001中劑量組 6 0.18±0.01 0.20±0.01 0.28±0.02 0.012±0.001 0.002±0.001 0.006±0.001高劑量組 6 0.25±0.01a 0.17±0.02a 0.19±0.01a 0.017±0.002a 0.002±0.001a 0.012±0.001a LY294002 組 6 0.28±0.02a 0.18±0.01a 0.07±0.01a 0.027±0.002a 0.002±0.001a 0.016±0.001a F值 3.06 2.76 2.94 3.19 2.26 4.15 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表4 六組大鼠大腦皮質和外周血NO、MDA和SOD水平比較（±s）Table 4 Comparison of NO，MDA and SOD in cerebral cortex and peripheral blood in the six groups

表4 六組大鼠大腦皮質和外周血NO、MDA和SOD水平比較（±s）Table 4 Comparison of NO，MDA and SOD in cerebral cortex and peripheral blood in the six groups

注：NO=一氧化氮，MDA=丙二醛，SOD=超氧化物歧化酶；與對照組比較，aP＜0.05；與高劑量組比較，bP＜0.05

組別 只數 NO（μmol/g） MDA（nmol/ml） SOD（U/mg）大腦皮質 外周血 大腦皮質 外周血 大腦皮質 外周血空白對照組 6 7.13±0.04 13.32±3.61 4.97±0.01 11.82±2.28 136.51±16.31 160.31±32.85對照組 6 0.83±0.01 3.49±0.05 13.25±4.32 19.45±3.16 68.61±13.92 50.64±3.6低劑量組 6 0.84±0.01 3.65±0.04 9.28±2.12 19.19±2.76 69.37±12.83 46.72±5.93中劑量組 6 4.16±0.01 6.16±0.03 7.35±3.28 16.08±1.92 90.58±20.06 69.32±3.86高劑量組 6 4.95±0.01a 8.34±0.04a 5.09±1.54a 14.11±4.38a 116.82±40.31a 92.34±31.30a LY294002 組 6 5.18±0.01 10.25±0.02 4.99±0.59b 10.37±2.06b 126.28±5.27b 127.29±2.14b F值 3.54 4.39 4.28 5.36 10.54 12.82 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

MDA是一種脂質過氧化物，是檢測細胞氧化損傷的重要指標，可反映自由基對組織和細胞的損傷程度；SOD是一種內源性抗氧化酶，可抑制活性氧簇（ROS）產生，可反映機體清除氧自由基的能力。既往研究表明，ROS在腦卒中所致腦組織損傷中具有重要作用。缺血再灌注組織中產生的ROS可被代謝為前列腺素和白三烯，導致白細胞趨化并控制血管內皮細胞功能［20］。本研究結果顯示，高劑量組大鼠大腦皮質和外周血SOD水平高于對照組、LY294002組，大腦皮質和外周血MDA水平低于對照組、LY294002組，提示大劑量POG對腦卒中大鼠腦組織脂質過氧化有保護作用。

NO是由一氧化氮合酶（NOS）催化L精氨酸（L-Arg）末端胍基氮氧化而成［21］。NO與心血管、神經、胃、腎和肝臟疾病密切相關［22］，其是一種新的免疫分子和炎性遞質，可介導內毒素、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）等細胞因子。eNOS既可產生NO擴張血管，還可產生超氧化物收縮血管。既往研究表明，谷胱甘肽化修飾參與氧化應激過程，是eNOS氧化還原的開關［23］。相關研究表明，高血壓患者血管NO增多，與血管擴張功能受損有關［24］。這種氧化應激也同時發生在心臟病發作、腦卒中、糖尿病和癌癥中，提示為恢復NOS的正常功能而對這種氧化還原開關進行復位可能是一種潛在的治療方法。本研究結果顯示，高劑量組大鼠大腦皮質和外周血NO水平高于對照組，提示高劑量POG可減輕腦卒中大鼠腦組織損傷。本研究結果還顯示，低、中、高劑量組各指標間無統計學差異，表明腦卒中大鼠對POG無劑量依賴性。

綜上所述，POG可通過抑制PI3K/AKT-eNOS信號通路及脂質過氧化而減輕腦卒中大鼠腦組織損傷，具有抗細胞凋亡、保護血管等作用，且無劑量依賴性；但本研究納入樣本量有限，可能會對實驗結果造成影響，后期仍需擴大樣本量繼續深入研究。

作者貢獻：古長維進行文章的構思與設計，撰寫淪為；劉仲、武苗苗進行研究的實施及可行性分析；辛紅娟進行數據收集、整理、分析；黨曉燕進行結果的分析與解釋，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理；劉仲、武苗苗、辛紅娟負責論文的修訂。

本文無利益沖突。