子宮內膜癌組織微小RNA-373表達情況及其對子宮內膜癌細胞增殖、遷移的影響研究

孟圓圓，遲鵬宇，馬麗輝，陳敏，孫冬霞，龐嵐，李燕

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統常見惡性腫瘤之一，其發病率僅次于宮頸癌［1］。EC早期常無明顯臨床癥狀，確診時常處于晚期且病情進展較快，患者預后不佳［2］。目前，手術、放療、藥物或三者聯合是臨床治療EC的常用手段［3］，經治療后患者5年生存率為70%～80%［4］，但EC的具體發病機制尚不清楚，因此臨床迫切需要尋找有助于早期診斷及治療EC的靶分子。微小RNA（miRNA）是長度為l9～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，可直接調控靶基因表達，參與人類多種癌癥的發生發展過程［5］。研究表明，miRNA-944在EC組織中呈高表達，并可促進腫瘤形成［6］。近年越來越多研究開始關注miRNA-373在惡性腫瘤（如肝癌［7］、肺癌［8］）發生發展過程中的作用，但其在EC中的作用鮮有報道。本研究旨在探討EC組織miRNA-373表達情況及其對EC細胞增殖、遷移的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年6月—2013年6月在邯鄲市婦幼保健院行手術治療的64例EC患者的EC組織作為試驗組，患者年齡32～63歲，平均年齡（52.1±6.4）歲。納入標準：（1）病歷資料完整；（2）病理檢查結果為EC；（3）術前未行其他治療。排除標準：（1）合并其他類型惡性腫瘤者；（2）合并全身感染性疾病者；（3）合并心、肺、肝、腎等重要臟器及血液、內分泌、免疫等系統疾病者。另選取同期在邯鄲市婦幼保健院行子宮切除術的30例良性子宮肌瘤患者的正常組織作為對照組。所有組織標本經液氮冷凍后于-80 ℃冰箱中儲存備用。本研究經邯鄲市婦幼保健院醫學倫理委員會審核批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-373、大型腫瘤抑制基因2（LATS2）檢測方法 采用美國Invitrogen公司生產的Trizol試劑提取兩組組織標本中總RNA，采用RevertAid RT Reverse Transcription試劑盒（Thermo Fisher Scientific，Inc）進行cDNA合成，并應用SYBR Green RT-qPCR 試 劑 盒（Kapa Biosystems，Inc.，MA，USA）檢測mRNA表達水平。實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）擴增體系為10 ml，反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共 40個循環。U6、GAPDH分別作為miRNA-373和LATS2的內參。每個組織標本重復檢測3次，應用2-ΔΔct法計算miRNA-373、LATS2相對表達量。miRNA-373引物序列： 正 向：5'-GAAGTGCTTCGATTTTGGGGTGT-3'，反 向：5'-TGCCGCCTGAACTTCACTCC-3'；LATS2引物序列：正向：5'-ATGAGCTCCACTCTGCTC AATGTCACGG-3'， 反 向：5'-GCAAGCTTCTCT ACCAAGAATGAAAGAGCAT-3'；U6引 物 序 列：正 向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， 反 向：5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH引物序列：正向：5'-GCACCGTCAAG GCTGAGAAC-3'，反向：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.2.2 隨訪 EC患者術后均進行電話及門診隨訪，并統計其術后5年生存情況，終點事件為死亡。

1.2.3 細胞實驗方法

1.2.3.1 細胞系培養 人子宮內膜腺癌細胞系AN3CA、HEC-1A、HEC-1B和永生化人子宮內膜基質細胞T-HESC均購自中國科學院上海細胞庫，將各細胞置于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640（HyClone，Logan，UT，USA）中，在37 ℃含5%二氧化碳（CO2）恒溫培養箱中培育。與T-HESC細胞相比，AN3CA、HEC-1A、HEC-1B細胞系中miRNA-373表達上調，且HEC-1B細胞系中miRNA-373表達上調最明顯，因此本研究選擇HEC-1B細胞系進行后續實驗。

1.2.3.2 細胞轉染 miRNA-373模擬物（miRNA-373 mimic）、miRNA-373抑制劑（miRNA-373 inhibitor）及其相對陰性對照物（分別為mimic-NC，inhibitor-NC）均購自GenePharma（中國上海）。采用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，USA） 試 劑盒進行轉染，分別采用miRNA-373 mimic、miRNA-373 inhibitor、mimic-NC，inhibitor-NC轉染HEC-1B細胞，具體操作如下：將3×105個細胞接種至6孔細胞培養板，在融合度達到50%時加入配置好的轉染物（10 μl miRNA-373 mimic或miRNA-373 inhibitor或mimic-NC或inhibitor-NC+125 μl無血清無抗生素培養基+5 μl Lipofectamine 2000試劑）并置于培養箱中培養，本研究細胞轉染率約為70%。

1.2.3.3 細胞增殖 采用噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖情況，具體操作如下：將分別轉染miRNA-373 mimic、miRNA-373 inhibitor、mimic-NC，inhibitor-NC的HEC-1B細胞4×103個置于96孔板中孵育，分別于轉染0、24、48、72、96 h后將細胞在含1 mg/ml 37 ℃MTT無血清培養基中培養4 h，去上清液后溶解在二甲基亞砜中（100 ml），采用Molecular Devices酶標儀在波長570 nm處讀取吸光度值，以轉染時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.2.3.4 細胞遷移 采用穿梭小室（Transwell）（8 μm孔徑膜）檢測細胞遷移，具體方法如下：分別將轉染miRNA-373 mimi、miRNA-373 inhibitor、mimic-NC、inhibitor-NC的HEC-1B細胞在無血清培養基溫育24 h，將3×104個HEC-1B細胞放入上室中，同時將含有10% FBS的遞質置于下室中，24 h后在37 ℃環境下完全除去非遷移細胞；采用4%多聚甲醛固定遷移細胞，0.5%結晶紫染色液染色，顯微鏡下計數遷移細胞數量。

1.2.4 基因檢測方法 采用雙熒光素酶報告基因系統驗證miRNA-373與LATS2間的靶標關系，主要技術流程如下：采用生物信息學方法分析并預測啟動子區可能的轉錄因子結合位點；將野生型或突變型LATS2〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕的3'-UTR插入pGL3-basic質粒載體（Promega，Madison，USA）中，擴增、克隆并提純質粒備用；將野生型或突變型LATS2和miRNA-373 miminc的3'-UTR轉染至HEC-1B細胞中，24 h后使用DualGlo熒光素酶測定試劑盒（Promega）檢測相對熒光強度以分析熒光素酶活性，并與空載對照比較。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料分析采用χ2檢驗；采用Graphpad Prism 6軟件繪制Kaplan-Meier生存曲線以分析不同miRNA-373表達情況EC患者術后5年預后，采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床研究結果

2.1.1 miRNA-373表達情況 對照組miRNA-373相對表達量為（0.48±0.17），試驗組為（1.32±0.29）；試驗組miRNA-373相對表達量高于對照組，差異有統計學意義（t=2.634，P=0.008）。

2.1.2 術后5年預后 根據miRNA-373平均值將試驗組患者分為低表達組（n=26）和高表達組（n=38），Kaplan-Meier生存曲線顯示，高表達組患者術后5年累積生存率為52.6%，低于低表達組的84.6%，差異有統計學意義（χ2=5.682，P=0.020，見圖1）。

2.2 細胞實驗結果

2.2.1 LATS2表達 轉染miRNA-373 mimic的HEC-1B細胞LATS2相對表達量為（0.42±0.06），低于轉 染 mimic-NC的 HEC-1B細 胞 的（0.91±0.18），差異有統計學意義（t=3.143，P=0.032）；轉染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細胞LATS2相對表達量為（2.03±0.02），高于轉染inhibitor-NC的HEC-1B細胞的（1.11±0.08），差異有統計學意義（t=3.626，P=0.014）。

2.2.2 細胞增殖 轉染96 h后，轉染miRNA-373 mimic的HEC-1B細胞吸光度值高于轉染mimic-NC的HEC-1B細胞，差異有統計學意義（t=3.499，P=0.023，見圖2A）；轉染96 h后，轉染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細胞吸光度值低于轉染inhibitor-NC的HEC-1B細胞，差異有統計學意義（t=3.256，P=0.015，見圖2B）。

圖1 不同miRNA-373表達情況EC患者術后5年生存情況的Kaplan-Meier生存曲線Figure 1 Kaplan-Meier survival curve for postoperative five-year survival status in EC patients with different expression of miRNA-373

2.2.3 細胞遷移 轉染miRNA-373 mimic的HEC-1B細胞中遷移細胞數量為（178±12）個，多于轉染mimic-NC的HEC-1B細胞的（77±25）個，差異有統計學意義（t=4.585，P=0.006）；轉染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細胞中遷移細胞數量為（25±6）個，少于轉染inhibitor-NC的HEC-1B細胞的（70±10）個，差異有統計學意義（t=4.061，P=0.002）。

2.3 基因檢測結果 生物信息學分析結果顯示，LATS2含有miRNA-373的潛在結合位點（見圖3）。雙熒光素酶報告基因系統檢測結果顯示，野生型LATS2中miRNA-373相對熒光強度為（0.24±0.05），低于空載對照的（0.96±0.07），差異有統計學意義（t=5.287，P＜0.01）；突變型LATS2中miRNA-373相對熒光強度為（0.98±0.04），與空載對照的（0.96±0.07）比較，差異無統計學意義（t=0.281，P=0.928）。

圖2 miRNA-373 mimic、miRNA-373 inhibitor轉染HEC-1B細胞后不同時間點吸光度值變化Figure 2 Changes of optical density in HEC-1B cells after transfection of miRNA-373 mimic or miRNA-373 inhibitor at different time points

圖3 LATS2結合位點和miRNA-373基因啟動子的示意圖Figure 3 Schematic diagram for LATS2 binding site and miRNA-373 gene promoter

3 討論

EC患者常無特異性臨床表現，但患者病情進展快、發病過程復雜、預后差。隨著近年科學技術發展，EC的診斷和治療雖有了很大程度改善，但EC晚期患者生存率仍較低，預后仍不樂觀［9］。研究表明，miRNA可通過靶向癌基因或抑制癌基因而延緩癌癥進展，且多種miRNA在癌癥患者中存在異常表達［6］。miRNA-373是miRNA的一員，參與了多種癌癥的發生發展過程，如腎細胞癌［10］、胃癌［8］等。譚飛非等［11］研究結果顯示，miRNA-373在EC組織中呈高表達，但其潛在作用機制尚不清楚。本研究結果顯示，試驗組miRNA-373相對表達量高于對照組，且高表達組患者術后5年累積生存率低于低表達組，提示miRNA-373有可能作為早期診斷EC并預測EC患者不良預后的生物學靶分子。

miRNA-373與多種腫瘤的發生發展密切相關。2006年，VOORHOEVE等［12］首次發現并證實miRNA-373是致癌基因，并可促進惡性腫瘤形成。近年研究表明，在食管鱗狀細胞癌中miRNA-373會通過抑制TIMP3表達而增強細胞侵襲和遷移能力［8，12］；在肝癌中，miRNA-373 inhibitor可通過下調miRNA-373的表達而抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡［7］。本研究結果顯示，轉染96 h后，轉染miRNA-373 mimic的HEC-1B細胞吸光度值高于轉染mimic-NC的HEC-1B細胞；轉染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細胞吸光度值低于轉染inhibitor-NC的HEC-1B細胞；轉染miRNA-373 mimic的HEC-1B細胞中遷移細胞數量于轉染mimic-NC的HEC-1B細胞；轉染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細胞中遷移細胞少于轉染inhibitor-NC的HEC-1B細胞，提示miRNA-373表達上調可促進EC細胞增殖、遷移，而下調其表達則可抑制EC細胞增殖、遷移，與miRNA-373 在胃癌［13］、纖維肉瘤［14］、膀胱癌［15］中的作用相似。也有研究表明，miRNA-373在結腸癌［15］、膠質瘤［16］、非小細胞肺癌［17］中具有抑癌作用，分析其原因可能為：惡性腫瘤形成是一個非常復雜的過程，并受到多種因素影響，miRNA-373在不同腫瘤中可能通過不同途徑發揮促癌或抑癌作用。

LATS2是Hippo途徑的重要組成部分，在細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲過程中具有至關重要的調節作用［18］。研究表明，LATS2作為一種腫瘤抑制因子，可下調B淋巴細胞-2基因（Bcl-2）和B淋巴細胞-xl基因（Bcl-xl）并促進細胞凋亡［19］；此外，LATS2高表達還能通過抑制素鼠雙微體蛋白2（Mdm2）的E3泛素連接酶活性而導致G1/S期細胞周期停滯［20］。此外，miRNAs主要通過調控靶基因而參與細胞增殖、分化、凋亡等過程，而LATS2作為抑癌基因已被多種miRNAs作為靶向位點，如LATS2可作為miRNA-135b靶向位點并促進乳腺癌細胞增殖［21］。GAO等［22］研究表明，miRNA-31可通過Hippo途徑而抑制LATS2表達，進而激活上皮-間質轉化，促進食管鱗狀細胞癌的發生發展。本研究結果顯示，LATS2含有miRNA-373的潛在結合位點，提示EC組織細胞中miRNA-373可直接靶向調節LATS2的表達。值得注意的是，已有研究證實，miRNA-373轉錄后可調節LATS2的表達并刺激人食管癌細胞增殖［23］。本研究結果顯示，野生型LATS2中miRNA-373相對熒光強度低于空載對照，突變型LATS2中miRNA-373相對熒光強度與空載對照比較無統計學差異；轉染miRNA-373 mimic的HEC-1B細胞LATS2相對表達量低于轉染mimic-NC的HEC-1B細胞，而轉染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細胞LATS2相對表達量高于轉染inhibitor-NC的HEC-1B細胞，提示miRNA可能通過靶向調節LATS2的表達而促進EC細胞增殖、遷移。

綜上所述，miRNA-373在EC組織中呈高表達，其可能通過靶向調節LATS2的表達而促進EC細胞增殖、遷移，進而影響EC患者預后，這為EC發生發展機制提供了一定的理論基礎；但本研究未探討miRNA-373調節LATS2的具體機制，仍需后續研究進一步探索。

作者貢獻：孟園園、李燕進行試驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；遲鵬宇、馬麗輝、陳敏進行試驗實施、評估、資料收集；龐嵐進行數據整理并指導撰寫論文；孫冬霞進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。