穿心蓮內酯對骨肉瘤143B細胞的抑制作用及其機制*

黃華坤，袁曉慧，張 平，喻婷婷，張露露，楊春梅，羅小輯，羅進勇△

（1重慶醫科大學檢驗醫學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶400016；2重慶醫科大學附屬第一醫院骨科，重慶400016）

骨肉瘤是最常見的惡性原發性骨腫瘤［1］，其具有較高的局部侵襲和早期轉移的趨勢［2］。目前，治療骨肉瘤的方法主要是化療［3］和放療［4］，但是無論是放療還是化療都有患者承受不起的巨大副作用。鑒于此，臨床上急需容易獲取、療效好而藥物毒副作用低的新型藥物用于骨肉瘤的輔助治療。

穿心蓮內酯（andrographolide，AG）是從穿心蓮植物中提取出來，具有多種藥理活性，相關文獻研究了穿心蓮內酯治療人類癌癥和免疫細胞的細胞過程和調控靶點［5］。隨著對穿心蓮內酯研究的深入，發現其還有抗炎［6-8］、抗病毒［9-10］、抗腫瘤和保護中樞神經系統作用［11-12］。文獻研究表明，穿心蓮內酯可以很好地抑制膀胱癌［13］、前列腺癌［14］、口腔癌［15］、胃癌［16］、結腸癌［17］、乳腺癌［18］等多種腫瘤，且抗腫瘤作用效果好，毒副作用較小。然而，目前穿心蓮內酯在骨肉瘤方面的研究還比較少。本研究旨在討論穿心蓮內酯對人骨肉瘤143B細胞增殖、遷移和侵襲等方面的抑制作用及促凋亡作用，再深入探討其潛在的分子機制，為臨床上骨肉瘤的治療提供一個新的方向。

材料和方法

1 細胞株與主要試劑

骨肉瘤143B細胞（重慶醫科大學臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室保存備用）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；ExCell Bio）；DMEM高糖培養基（HyClone）；穿心蓮內酯（成都瑞芬思生物科技有限公司）；MTT（Sigma）；青霉素+鏈霉素和Lipofectamine 2000（Thermo Scientific）；Hoechst 33258 染液（Solarbio）；結晶紫染液、蛋白提取試劑盒及Western blot相關試劑（上海碧云天公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；BioFrox）；孔徑為8 μm的Transwell小室（Corning）；基質膠（BD Biosciences）；熒光素酶檢測試劑盒（New England Biolabs）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜和化學發光試劑盒（Millipore）；鼠抗人Snail及Bcl-2單克隆抗體，兔抗人基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、波形蛋白（vimentin）、β-catenin和c-Myc單克隆抗體，兔抗人cleaved caspase-3和caspase-3多克隆抗體（CST）；鼠抗人β-actin單克隆抗體（鐘鼎生物）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG（II抗；北京中杉金橋生物技術有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養 人骨肉瘤細胞用含5 mL青霉素+鏈霉素配制成的10%DMEM高糖培養液（10%FBS），置于含5%CO2的37℃培養箱中培養。待細胞融合度達80%～90%時，即可以進行傳代培養。

2.2 結晶紫染色實驗檢測143B細胞總數 當143B細胞融合度達80%～90%時，用胰酶消化細胞（在鏡下觀察到細胞形態開始變圓時，即終止消化），然后用10%FBS重懸細胞，制備成單細胞懸液。將10 μL的細胞懸液打進牛鮑計數板中，顯微鏡下計數。向24孔板中的每個孔加入500 μL含4×104個細胞的10%FBS。待細胞融合度達50%時，將細胞分為溶劑DMSO對照（control）組及0、5、10、15和20 μmol/L AG（用DMSO溶解成40 mmol/L的儲存液）處理組，每個濃度均有3個復孔。分別在AG處理后的24、48和72 h后，取出相應時間的24孔板，用PBS洗滌2次，然后用4%的多聚甲醛37℃孵育箱中固定20 min，棄去多聚甲醛，在暗處將結晶紫染料加入到每個孔中（結晶紫染料以覆蓋住孔底為宜），避光染色10 min，用水沖洗剩余的結晶紫染料，干燥后掃描儀掃描孔板。然后向每個孔加入10%的冰乙酸500 μL，并在震蕩儀上室溫適當震蕩10 min，以便結晶紫充分溶解，并使用酶聯免疫檢測儀測定570 nm處各孔的吸光度（A）。此實驗重復3次。細胞相對生長率（%）=（control組A值-處理組A值）/control組A值×100%。

2.3 MTT實驗檢測143B細胞的活力 當143B細胞融合度達80%～90%時，用胰酶消化細胞（在鏡下觀察到細胞形態開始變圓時，即終止消化），然后用10%FBS重懸細胞，制備成單細胞懸液。將10 μL的細胞懸液打進牛鮑計數板中，顯微鏡下計數。向96孔板中的每個孔加入200 μL含4 000個細胞的10%FBS。待細胞融合度達50%時，按2.2所述分組，每個濃度均有2個復孔。分別在AG處理后的0、24和48 h后，取出相應時間的96孔板，往每個孔加入10 μL MTT溶液，放置37℃培養箱4 h后，棄去培養基，每孔加入100 μL DMSO，室溫避光適當震蕩10 min，然后使用酶聯免疫檢測儀在492 nm波長處檢測各孔的A值，并繪制細胞活力圖。重復3次此實驗。

2.4 集落形成實驗檢測143B細胞的集落形成能力 當143B細胞融合度達80%～90%時，用胰酶消化細胞（在鏡下觀察到細胞形態開始變圓時，即終止消化），然后用10%FBS重懸細胞，制備成單細胞懸液。將10 μL的細胞懸液打進牛鮑計數板中，顯微鏡下計數。每孔1 000個接種于6孔板中。待細胞完全貼壁后，將細胞分為control組及 0、1.875、2.5、3.125和3.75 μmol/L AG處理組。在37℃孵箱中培養7 d，棄去培養基，用PBS洗滌2次，然后用4%的多聚甲醛37℃孵育箱中固定20 min，棄去多聚甲醛，在暗處將結晶紫染料加入到每個孔中（結晶紫染料以覆蓋住孔底為宜），避光染色10 min，用水沖洗剩余的結晶紫染料，干燥后掃描儀掃描孔板。鏡下計數大于50個細胞的集落為有效細胞集落。重復此實驗3次。集落形成率（%）=有效細胞集落數/總細胞集落數100%。

2.5 細胞Hoechst 33258染色檢測143B細胞凋亡水平 當143B細胞融合度達80%～90%時，用胰酶消化細胞（在鏡下觀察到細胞形態開始變圓時，即終止消化），然后用10%FBS重懸細胞，制備成單細胞懸液。將10 μL的細胞懸液打進牛鮑計數板中，顯微鏡下計數。向24孔板中的每個孔加入500 μL含4×104個細胞的10%FBS。待細胞貼壁生長融合度到50%的時候，按2.2所述分組，分別處理細胞24 h，每個濃度均有3個復孔。待處理時間結束后，取出24孔板，棄去培養基后用PBS洗滌兩次，然后用4%的多聚甲醛37℃孵育箱中固定20 min，棄去多聚甲醛，每孔加入0.01 g/L的Hoechst 33258染液300 μL，避光靜止10 min，棄去染液。在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞核形態及大小出現明顯改變時，對每個視野的凋亡細胞數進行計數分析。重復此實驗3次。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

2.6 流式細胞術檢測143B細胞凋亡水平 當143B細胞融合度達80%～90%時，用胰酶消化細胞（在鏡下觀察到細胞形態開始變圓時，即終止消化），然后用10%FBS重懸細胞，制備成單細胞懸液。將細胞加入到6 cm培養皿中，待待細胞貼壁生長融合度到50%的時候，按2.2所述分組，分別處理細胞24 h，每個濃度均有3個復孔。待處理時間結束后，0.25%胰蛋白酶消化細胞，800 r/min離心3 min。棄上清，PBS洗滌，重復3次，最后一次用500 mL PBS重懸細胞。具體操作方法按照annexin V-FITC/PI試劑盒說明書進行操作，然后經流式細胞儀檢測骨肉瘤143B細胞凋亡情況。

2.7 細胞劃痕愈合實驗檢測143B細胞的遷移能力 當143B細胞融合度達80%～90%時，用胰酶消化細胞（在鏡下觀察到細胞形態開始變圓時，即終止消化），然后用10%FBS重懸細胞，制備成單細胞懸液。將10 μL的細胞懸液打進牛鮑計數板中，顯微鏡下計數。向6孔板中每個孔加入2 mL含有1×105個細胞的10%FBS，待細胞貼壁長滿整個孔板后，按2.2所述分組并分別處理細胞，并且在處理后的0、18和36 h分別記錄相對應點上同一位置的劃痕區域的寬度來反應AG對骨肉瘤143B細胞遷移能力的影響。劃痕愈合率（%）＝（0 h劃痕寬度-36 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

2.8 Transwell細胞侵襲實驗檢測143B細胞的侵襲能力 基質膠原液用DMEM稀釋20倍，將Transwell小室放置于24孔板中，往Transwell小室上室加入60 μL稀釋20倍的基質膠。放入37℃孵育箱中，待基質膠凝固后，棄去小室中剩余的液態培養基。取融合度達80%～90%的143B細胞，用胰酶消化細胞（在鏡下觀察到細胞形態開始變圓時，即終止消化），然后用10%FBS重懸細胞，制備成單細胞懸液。將10 μL的細胞懸液打進牛鮑計數板中，顯微鏡下計數。并向每個小室的上室加入400 μL含2.5×105個細胞的DMEM，按2.2所述分組并分別處理細胞，然后在下室加入500 μL 10%FBS，37℃孵育箱培養24 h。24 h后取出Transwell小室，棄去剩余的培養基，用PBS洗滌2次，然后用4%的多聚甲醛37℃孵育箱中固定20 min，棄去多聚甲醛，用棉簽擦掉上室中未穿透小室膜的細胞。在暗處用結晶紫染料染色，避光染色10 min，用水沖洗剩余的結晶紫染料。干燥后在光學顯微鏡下觀察并拍照，顯微鏡下取3個隨機視野計數并統計結果。

2.9 Western blot檢測相關蛋白的表達 取細胞融合度達50%的143B細胞，按2.2所述分組并分別處理細胞，24 h后分別提取總蛋白，用BCA法測定各組蛋白濃度，分別加入蛋白上樣緩沖液后（蛋白量與緩沖液比值為4∶1），于沸水中煮10 min使蛋白變性，-80℃儲存。將適量蛋白樣品加入到10%SDSPAGE，恒壓濃縮和分離蛋白，恒流（210 mA）將蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%BSA封閉液在37℃封閉3 h，然后加入相對應的I抗（1∶1 000稀釋）于4℃放置12～16 h。在震蕩儀上用TBST洗膜3次，每次10 min。然后加入相對應的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG II抗（1∶5 000稀釋）于37℃孵育1 h，再用TBST洗膜3次，每次10 min，用化學發光成像儀成像。顯色結果用Image Lab軟件分析。

3 統計學處理

各實驗均獨立重復3次后，用GraphPad Prism 5進行數據分析。實驗數據用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內差異采用Tukey檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 AG對143B細胞增殖的抑制

結晶紫染色結果顯示，143B細胞分別經過不同濃度（5、10、15、20）μmol/L AG處理24、48和72 h后，與空白組相比，細胞總數出現濃度依賴性下降。（P＜0.01），見圖1A。隨后，我們使用低濃度AG（0 μmol/L、1.875 μmol/L、2.5 μmol/L、3.125 μmol/L和3.73 μmol/L）處理143B細胞，經過7 d的培養，與空白組相比，隨著AG濃度增加，143B細胞集落形成數目明顯減少（P＜0.01），見圖1B。MTT實驗檢測結果所示，與空白組相比，經過AG處理48 h后，15 μmol/L和20 μmol/L AG處理組中143B細胞的活力明顯受到抑制（P＜0.01），見圖1C。Western blot結果同樣顯示，143B細胞經過AG各組處理后，AG可下調143B細胞中增殖相關蛋白PCNA的水平（P＜0.01），見圖1D。由此表明AG可抑制骨肉瘤143B細胞的增殖，且這種抑制效果呈濃度依賴性。

2 穿心蓮內酯誘導骨肉瘤143B細胞凋亡

Hoechst 33258染色結果所示。143B細胞經過AG各組處理后，細胞出現不同程度的凋亡，其中空白組細胞凋亡率為（2.45±0.80）%，20 μmol/L AG處理組凋亡率為（68.33±1.51）%，處理組較空白組凋亡率顯著升高（P＜0.01），見圖2A。流式細胞術檢測所示，143B細胞經過AG各組處理后，各處理組與空白對照組的早期和晚期凋亡率差異明顯，特別是10 μmol/L、15 μmol/L和20 μmol/L AG 處理組（均P＜0.01），見圖2B。Western blot結果同樣顯示，143B細胞經過AG各組處理后，AG可下調143B細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的水平（P＜0.05）、上調促凋亡蛋白Bax的水平（P＜0.05），凋亡相關蛋白總 caspase-3和PARP下降，而剪切的caspase-3（c-caspase-3）和剪切的PARP（c-PARP）蛋白水平上升（P＜0.01），見圖2C。以上結果均表明AG可以誘導143B細胞凋亡。

3 AG抑制骨肉瘤143B細胞的遷移及其侵襲能力

劃痕愈合實驗結果顯示，經過20 μmol/L AG處理36 h后，143B細胞的遷移能力明顯受到抑制，愈合率僅為（36.43±2.57）%，而與空白組0 h（左上）相比，36 h后空白組（左下）的細胞劃痕愈合率高達（87.26±2.21）%，處理組較空白組遷移能力顯著降低（P＜0.01），見圖3A。隨后，我們使用Transwell小室實驗檢測AG對143B細胞侵襲能力的影響，經過24 h處理后，空白組中穿透小室的143B細胞數量為（405±5）個，而20 μmol/L AG處理組中，穿過小室的細胞數為（112±6）個，數量明顯減少（P＜0.01），見圖3B。Western blot結果同樣顯示，遷移侵襲相關蛋白MMP-9、vimentin和Snail的表達水平明顯下降（P＜0.01），見圖3C。以上結果均表明經AG處理，143B細胞的遷移和侵襲能力顯著受到抑制。

4 AG抑制骨肉瘤143B細胞中的Wnt/β-catenin信號通路

Wnt信號通路的激活是骨肉瘤發生發展的重要因素，鑒于此，本研究使用Western blot檢測Wnt信號通路中的β-catenin及其下游靶分子c-Myc的表達量。結果顯示，15 μmol/L和20 μmol/L AG處理組與空白組相比，143B細胞中β-catenin和c-Myc的表達明顯降低（P＜0.01），見圖4。由此提示AG可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而抑制骨肉瘤143B細胞的增殖和侵襲，并促其凋亡。

討 論

骨肉瘤是一種多發于青少年兒童的原發性骨惡性腫瘤，主要發生在骨遠端管狀骨和肱骨近端，具有惡性程度高、遠端轉移早的特點，也是其死亡的主要原因。手術治療和輔助化療是治療骨肉瘤的主要方法［19］。然而，目前的化療藥物如順鉑、5-氟尿嘧啶、阿霉素、甲氨蝶呤等有骨髓抑制、肝功能損傷、惡心嘔吐等許多副作用［20］。因此，尋找新的、治療效果好的、毒副作用低的抗腫瘤藥物已經成為人們關注的重點。

Figure 1.Effect of andrographolide（AG）on the proliferation of osteosarcoma 143B cells.A：the change of the total number of 143B cells after AG treatment was detected by crystal violet staining；B：the colony formation ability of 143B cells was detected by the colony formation assay（crystal violet staining）；C：the viability of 143B cells was detected by MTT assay；D：the expression of proliferation-related protein PCNA was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 AG對骨肉瘤143B細胞增殖能力的影響

穿心蓮內酯是從穿心蓮植物中提取出來，具有多種藥理活性。據大量文獻報道，AG具有抗多種腫瘤的作用，而且效果顯著。AG可以通過將細胞周期阻滯在G2/M期，從而抑制前列腺癌［14］、胃癌［16］和黑色素瘤細胞［21］增殖；還可抑制TLR4信號通路活性，誘導結腸癌［17］和前列腺癌［22］凋亡；AG可通過下調Bcl-2的蛋白水平，并激活caspase信號級聯從而誘導胃癌細胞［16］凋亡；通過上調miR-218抑制口腔癌侵襲性，降低Bmi1的表達而抑制口腔癌的干性［15］。還可以與阿霉素連用而發揮抑制乳腺癌的生長和轉移的作用［23］。以上的研究結果充分說明穿心蓮內酯可以通過多種途徑發揮抑癌作用。但是，AG對人骨肉瘤的影響和作用及其潛在的機制仍然有待進一步的探索。

Figure 2.Effect of andrographolide（AG）on the apoptosis of osteosarcoma 143B cells.A，B：Hoechst 33258 staining（×200）and flow cytometry were performed to detect the apoptosis of 143B cells；C：the protein levels of antiapoptotic protein Bcl-2，pro-apoptotic protein Bax，and apoptosis-related proteins caspase-3，cleaved caspase-3（c-caspase-3），PARP and cleaved PARP（c-PARP）were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 AG對骨肉瘤143B細胞凋亡的影響

Figure 3.A：the wound-healing test was performed to measured the effect of andrographolide on the migration ability of osteosarcoma 143B cells（×100）；B：the effect of andrographolide on the invasive ability of osteosarcoma 143B cells was tested by transwell assay（crystal violet staining，×100）；C：the protein levels of migration and invasion related proteins vimentin，Snail and MMP-9 were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 AG對骨肉瘤143B細胞遷移和侵襲能力的影響

Figure 4.The effects of AG on the expression levels of Wnt/β-catenin pathway-related proteins（including β-Catenin and c-Myc）in the osteosarcoma 143B cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 AG對骨肉瘤143B細胞WNT信號通路相關蛋白表達的影響

本研究中，我們對AG作用于骨肉瘤143B細胞的抗腫瘤作用及其可能的機制進行了探索。細胞增殖失控是腫瘤細胞的基本特征，腫瘤細胞通過解除正常的促生長信號產生和釋放從而達到維持細胞增殖，抵抗凋亡的作用［24］。于是我們使用了結晶紫染色法、集落形成實驗和MTT實驗以及Western blot實驗去證實了AG能夠抑制骨肉瘤143B細胞的增殖，并且降低增殖相關蛋白PCNA的水平。細胞凋亡是細胞自殺或程序性細胞死亡，是通過激活進化保守的細胞通路介導的。凋亡可以通過外部或內部（線粒體）途徑發生。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1）和促凋亡蛋白（Bid、Bax、Bad）。當促凋亡蛋白在線粒體中被激活時，它與另一種促凋亡因子APAF1結合形成“凋亡體”復合物。然后凋亡體復合體激活一系列caspases，進而導致內源性細胞死亡。TNF受體超家族通過配體-受體相互作用發生，就會啟動capspase-8的激活，進而激活下游執行靶蛋白，觸發外源性細胞凋亡［25］。細胞凋亡為有效的抗癌治療提供了一些線索，但是缺乏凋亡誘導和不適當的凋亡控制過程涉及腫瘤的發展和進展以及耐藥。Sukardiman等［26］發現穿心蓮內酯具有誘導癌細胞凋亡的抗腫瘤作用。我們的研究結果表明，AG使143B細胞凋亡率增加，并且使抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下調，促進caspase凋亡途徑中cleaved caspase-3的蛋白水平增多，而使caspase-3的蛋白水平下降。因而可以說明AG可以促進143B細胞的凋亡。上皮-間質轉化是一個復雜的細胞過程，其主要特征是上皮細胞極性的喪失以及間質細胞特征的發展，促進了腫瘤細胞的遷移和侵襲能力［27］。拉毛卓瑪等［28］證實了上皮-間充質轉化可以促進肺鱗癌細胞的轉移。本研究通過Transwell小室實驗、劃痕愈合實驗以及Western blot實驗發現AG能夠顯著地抑制人骨肉瘤細胞143B細胞的遷移和侵襲，下調遷移侵襲相關蛋白MMP-9、vimentin和Snail的表達水平。以上結果顯示，AG可能是通過逆轉骨肉瘤143B細胞EMT進程從而抑制其遷移和侵襲能力。

文獻報道Wnt信號通路的激活是骨肉瘤發生發展的重要因素［29］。而Wnt信號通路中的c-Myc的表達降低與抗腫瘤相關，并且將會影響腫瘤的發生發展［30］。本研究使用Western blot檢測后，發現AG可以明顯降低β-catenin蛋白的表達量，同時也使Wnt信號通路下游的靶蛋白c-Myc的表達量顯著下調。以上結果表明AG可能通過抑制143B細胞中的Wnt信號通路，從而發揮抗骨肉瘤的作用。

綜上所述，本研究證實了AG能抑制骨肉瘤143B細胞的遷移、侵襲和增殖作用，并且促進其凋亡，其潛在機制可能是抑制Wnt信號通路。這些結果證明，AG具有良好的抗癌作用，這可能為AG作為新的治療骨肉瘤候選藥物提供了重要的實驗依據。后續我們將進一步了解該藥物在實驗動物體內對骨肉瘤的抑制作用。