槲皮素通過上調(diào)SIRT1降低心肌缺血/再灌注微血管通透性*

劉振華，張艷紅，董 杰，韓麗萍

（溫州醫(yī)科大學低氧醫(yī)學研究所，浙江溫州325035）

急性心肌梗死是威脅人類健康的難治性疾病之一，其治療宗旨是盡早再通阻塞的血管以恢復缺血組織的供血，即再灌注［1］。但是血管成功再通后，仍有患者出現(xiàn)梗死面積擴大、心功能惡化以及梗死心室重塑加重的現(xiàn)象［2］，這說明再灌注雖然緩解了心肌缺血的狀況，卻使單純?nèi)毖鸬膿p傷惡化，導致心肌代謝紊亂、心肌超微結(jié)構(gòu)改變、心律失常以及舒縮功能障礙等，即心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［3］。目前的研究較多關注是恢復心肌細胞的血供及如何保護心肌細胞等方面，而給細胞提供血液的微血管本身的損傷和作用卻被忽視了［4］。心肌I/R時微血管損傷（microvascular damage，MVD）的病理生理后果主要體現(xiàn)在微血管阻塞（即無復流現(xiàn)象）和微血管屏障功能喪失（即微血管的通透性增高）兩個方面［5］。槲皮素（quercetin，Que）可顯著抑制多核粒細胞和過氧化氫的聚集，降低離體培養(yǎng)的人心臟毛細血管前微動脈的通透性，關閉開放的緊密連接，抑制內(nèi)皮細胞的肌動蛋白系統(tǒng)［6］，提示槲皮素可能具有減少I/R時微血管漏出的作用。且研究證實，槲皮素可以上調(diào)沉默信息調(diào)控因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的表達。SIRT1屬于sirtuins家族的成員，是NAD+依賴的表觀遺傳和代謝調(diào)節(jié)因子，可以去乙酰化核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的亞單位Rel A/p65，抑制其轉(zhuǎn)錄，減少 NF-κB刺激線粒體產(chǎn)生的氧自由基，從而發(fā)揮抗炎和抗氧化的作用［7］。因此，本論文擬驗證槲皮素是否可以通過激動SIRT1減輕微血管損傷進而緩解大鼠心肌I/R損傷。

材料和方法

1 實驗動物

雄性SD大鼠，體重220～250 g，由溫州醫(yī)科大學動物中心提供，合格證號SCXK（浙）2016-0011。動物生活環(huán)境恒溫（23±2）℃，常規(guī)24 h晝夜循環(huán)。

2 細胞和試劑

小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞系5（H5V）購自舜冉（上海）生物技術(shù)公司。槲皮素（Sigma）；選擇性SIRT1抑制劑EX527（MedChem Express）；抗SIRT1抗體（Proteintech）；抗ZO-1、肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）和肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）抗體（Abcam）；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco）；E-選擇素（E-selectin）、血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）、白細胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）和IL-6的 ELISA檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

3 實驗方法

3.1 在體心肌缺血/再灌注模型的建立 成年SD大鼠稱重，腹腔注射7%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉，固定于手術(shù)臺上。肢體末端皮下插入心電電極，術(shù)中連續(xù)監(jiān)測心電圖。剪開氣管進行氣管插管，連接動物呼吸機。剃毛開胸以暴露心臟，剪開心包，于冠狀動脈左室前降支離左心耳下緣約0.15 cm處繞左室支穿線結(jié)扎，缺血30 min后松開活結(jié)，拔去引線，再灌注60 min。以ST段明顯抬高為結(jié)扎成功（心肌缺血）的指標，剪開結(jié)扎線后ST段下降1/2以上表明復灌成功。假手術(shù)（sham）組只穿線不結(jié)扎，I/R組缺血30 min／再灌注60 min，Que+I/R組于再灌注前15 min尾靜脈注射Que（10 mg/kg），Que+EX527+I/R組于再灌注前15 min和30 min分別尾靜脈注射Que（10 mg/kg）和EX527（1 mg/kg）。

3.2 大鼠心電圖采集 使用RM6240系列多道生理信號采集處理系統(tǒng)采集心電圖信息。手術(shù)全程記錄心電圖變化，分析計數(shù)各組再灌注后室性心動過速（ventricular tachycardia，VT）、室性纖維顫動（ventricular fibrillation，VF）、室性異位節(jié)律（ventricular ectopic beats，VEBs）及房室傳導阻滯（atrial ventricular block，AVB）的發(fā)生率和心律失常的持續(xù)時間。

3.3 心肌組織HE染色 大鼠心臟取材后，以4%多聚甲醛固定24 h，再經(jīng)石蠟包埋做成5 μm切片，切片使用二甲苯脫蠟以及各級乙醇至水洗環(huán)節(jié)后，使用蘇木精及伊紅（HE）染色5～15 min，常規(guī)清洗、脫水、封片。于光學顯微鏡下觀察心臟組織學變化。

3.4 ELISA檢測血漿PAF、IL-1α和IL-6水平 缺血再灌注60 min后，從大鼠頸總動脈取2 mL血于促凝管中，1 000×g離心20 min，取上清液分裝于EP管中，-80℃保存以備檢測用。ELISA具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，通過酶標儀讀取數(shù)據(jù)。

3.5 單層內(nèi)皮細胞通透性的檢測 將小鼠H5V細胞接種于Transwell頂層小室，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2加95%O2常規(guī)培養(yǎng)，至細胞生長鋪滿后開始建立缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，即將培養(yǎng)液換成低糖DMEM培養(yǎng)基并加入 200 μmol/L CoCl2，于 37℃、5%CO2+95%N2孵箱中培養(yǎng)6 h后，棄去含CoCl2的培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，再換成不含CoCl2的正常培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)1 h。復氧的同時于頂層小室加入大分子熒光標記物FITC-dextran（Sigma）檢測內(nèi)皮通透性。實驗分為4組：對照（control）組、H/R組、Que（20 μmol/L）+H/R組和Que+EX527（5 μmol/L）+H/R組。

3.6 免疫熒光檢測ZO-1的表達 將細胞接種于6孔板，培養(yǎng)至細胞爬片，按上述分組處理后，1%多聚甲醛固定，5%小牛血清封閉1 h，加入稀釋好的熒光Ⅰ抗（抗ZO-1抗體）4℃過夜，PBS洗3次，避光加入稀釋好的熒光Ⅱ抗室溫孵育1 h。PBS洗3次，DAPI染核15 min，用抗熒光淬滅劑封片。

3.7 Western blot檢測蛋白表達 分別收集心肌組織和培養(yǎng)于6孔板的細胞，按比例加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。每個樣本取等量蛋白進行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉于室溫封閉1h后，加入稀釋好的Ⅰ抗（抗SITR1抗體、抗MLCP抗體、抗ZO-1抗體和抗β-actin抗體）4℃搖床孵育過夜。洗膜4次后，將膜與稀釋好的辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗在室溫輕搖1 h，洗膜后加顯影液顯影、定影、掃描。

3.8 H5V細胞骨架形態(tài)的檢測 將細胞培養(yǎng)至細胞爬片，按上述分組藥物處理完成后，棄去培養(yǎng)液，1%多聚甲醛固定，5%小牛血清封閉1 h，加入稀釋好的鬼筆環(huán)肽染料室溫孵育1 h，PBS洗3次，DAPI染核15 min，用抗熒光淬滅劑封片。Nikon倒置熒光顯微鏡拍照，檢測羅丹明標記的紅色熒光，不同組間成像系統(tǒng)參數(shù)設置一致。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組樣本比較選用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間差異的兩兩比較選用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 槲皮素減少大鼠I/R后心律失常的發(fā)生

手術(shù)心電圖監(jiān)測結(jié)果顯示，sham組大鼠心電圖ST段無明顯變化，I/R組大鼠心電圖在心肌缺血時ST段明顯抬高，在再灌注期間ST段又有明顯的回落，說明心臟缺血/再灌注模型制備成功，見圖1。心律失常統(tǒng)計結(jié)果表明，I/R組大鼠再灌注過程中，VT和VEB等心律失常現(xiàn)象均有發(fā)生，而Que+I/R組大鼠心肌再灌注性心律失常發(fā)生率顯著降低，持續(xù)時間縮短（P＜0.05）；與Que+I/R組相比，Que+EX527+I/R組的VT和VEB等心律失常現(xiàn)象發(fā)生的概率也有明顯的升高（P＜0.05），見表1。

Figure 1.Real-time ECG during whole surgery of I/R.圖1 實時監(jiān)測I/R手術(shù)全程心電圖的變化

表1 各組心律失常發(fā)生率比較Table 1.Comparison of arrhythmia incidence among the 4 groups（n=10）

2 槲皮素改善缺血/再灌注心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)

HE染色顯示，sham組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌細胞結(jié)構(gòu)正常，大小、形態(tài)一致，邊緣清晰，無細胞水腫及變性壞死出現(xiàn)，微血管完整；I/R組大鼠心肌細胞出現(xiàn)明顯變性壞死，廣泛水腫及大量炎癥細胞浸潤，細胞結(jié)構(gòu)排列不規(guī)則，細胞間隙明顯增大，部分區(qū)域心肌纖維組織出現(xiàn)缺失和斷裂，微血管被破壞；與I/R組比較，Que可明顯減輕心肌組織病理改變，Que+I/R組心肌纖維排列較為整齊，細胞結(jié)構(gòu)基本正常，間質(zhì)輕度水腫及散在炎細胞浸潤；Que+EX527+I/R組大鼠心肌組織仍可見局部心肌纖維排列纖紊亂或斷裂，間質(zhì)有較為明顯水腫及炎性細胞浸潤，見圖2。

Figure 2.The morphological changes of the myocardium（HE staining，×40）.圖2 各組心肌形態(tài)學改變

3 ELISA測定大鼠外周血血清E-選擇素和多種促炎因子的變化

Sham組血中E-選擇素含量較低，發(fā)生I/R損傷后，其含量明顯增加（P＜0.05）；使用槲皮素干預后，E-選擇素含量與I/R組相比有了明顯的降低（P＜0.05）；而在Que+EX527+I/R組中，E-selectin的含量較Que+I/R組顯著上升，見圖3。

Figure 3.The content of E-selectin in peripheral blood of each group was detected by ELISA.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs I/R group；△P＜0.05 vs Que+I/R group.圖3 ELISA檢測各組外周血中E-選擇素的含量

Sham組VCAM-1、PAF、IL-1α和IL-6的含量均較低，發(fā)生I/R損傷后，上述促炎因子的含量明顯增加（P＜0.05）；使用槲皮素干預后，其含量和I/R組相比有了明顯的降低（P＜0.05）；而用EX527抑制SIRT1的表達后，PAF、VCAM-1、IL-1α和IL-6的含量較Que+I/R組明顯回升，見圖4。

4 槲皮素降低單層內(nèi)皮細胞的通透性

FITC熒光值測定Transwell小室中培養(yǎng)的單層內(nèi)皮細胞通透性，結(jié)果顯示H/R組的熒光值與sham組相比顯著增高（P＜0.05）；Que+H/R組的熒光值較H/R組顯著降低，加入EX527后，這種熒光值又明顯升高（P＜0.05），見圖5。

5 槲皮素上調(diào)缺血/再灌注心肌組織SIRT1蛋白的表達

Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，I/R組的SIRT1表達水平顯著降低（P＜0.05）；而Que+I/R組的SIRT1表達水平則較I/R組顯著增高（P＜0.05），但加入EX527后，SIRT1蛋白的表達水平較Que+I/R組降低，見圖6。

6 槲皮素上調(diào)H/R后H5V細胞ZO-1和MLCP的表達

Western blot和免疫熒光，結(jié)果顯示H/R后ZO-1的表達顯著降低（P＜0.05）；使用槲皮素干預后，ZO-1表達量與H/R組相比有了明顯的回升（P＜0.05）；而用EX527抑制SIRT1的表達后，沒有出現(xiàn)ZO-1表達量回升的現(xiàn)象，見圖7和圖8。Western blot法檢測結(jié)果顯示，H/R后的H5V細胞的MLCP表達顯著降低（P＜0.05）；使用槲皮素干預后，MLCP的表達量與H/R組相比有了明顯的回升（P＜0.05）；而用EX527抑制SIRT1的表達后，沒有出現(xiàn)MLCP表達量回升的現(xiàn)象，見圖7。

7 槲皮素減少H/R后細胞骨架的重排

Figure 4.The content of proinflammatory factors in peripheral blood of each group were measured by ELISA.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs I/R group；△P＜0.05 vs Que+I/R group.圖4 ELISA檢測各組外周血中促炎因子的含量

Figure 5.The permeability of monolayer endothelial cells was evaluated by Transwell assay.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs H/R group；△P＜0.05 vs Que+H/R group.圖5 Transwell實驗檢測單層內(nèi)皮細胞的通透性

H/R誘導損傷后，H5V細胞的肌動蛋白排列紊亂，極性消失，細胞間縫隙增大。槲皮素干預后，肌動蛋白恢復規(guī)則排列。而用EX527抑制SIRT1的表達后，其排列與H/R組比較，未見明顯改善，見圖9。

討 論

急性心肌梗死是一種嚴重的心血管疾病，其發(fā)病機制是心臟冠狀動脈的急性閉塞引起的心肌血液供應快速的減少或中斷。急性心肌梗塞最有效的治療方法就是恢復冠狀動脈的血液流動，但這種治療方法會導致再灌注損傷，所以對再灌注損傷的研究及防治逐漸被研究者重視［8］。開發(fā)在緩解缺血性損傷的同時也能保護機體免受再灌注損傷的藥物是相當重要的，這也一直是研究的重點。

SIRT1是沉默信息調(diào)節(jié)因子2的酵母同源物，通過脫乙酰化組蛋白和非組蛋白調(diào)節(jié)線粒體凝聚和基因轉(zhuǎn)錄。它還可以調(diào)節(jié)應激反應、細胞存活和線粒體功能，參與代謝綜合征和動脈粥樣硬化相關血管疾病的多種病理生理過程，已有研究指出SIRT1將是人類心血管相關疾病的一個重要治療靶點［9］。大鼠在體實驗結(jié)果表明槲皮素可以減輕大鼠心肌I/R過程中微小血管損傷，同時SIRT1的表達也升高。體外實驗進一步證實了槲皮素可以上調(diào)SIRT1，并減少心肌微血管內(nèi)皮細胞H5V發(fā)生H/R時的細胞通透性。

在I/R損傷的過程中，血管內(nèi)皮細胞黏附因子會與中性粒細胞結(jié)合，大量炎癥因子被中性粒細胞釋放，這些炎癥因子又會引起血液中其他的中性粒細胞積聚，這種效應級聯(lián)放大，最終會引起血管內(nèi)皮細胞的收縮，血管壁通透性增加，這是造成多種血管功能障礙及組織損傷的機制之一［10］。本實驗ELISA結(jié)果表明，與sham組相比，I/R組外周血中內(nèi)皮損傷標志物E-選擇素和VCAM-1及炎癥因子PAF、IL-1α和IL-6的含量明顯增加，槲皮素干預，誘導SIRT1表達后，E-選擇素水平下降，以上炎癥因子表達均有明顯的減少，說明槲皮素有減輕心肌I/R時血管內(nèi)皮損傷，抑制炎癥反應的作用。

Figure 6.The SIRT1 expression in the myocardium was detected by Western blot.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs I/R group；△P＜0.05 vs Que+I/R group.圖6 Western blot檢測各組心肌SIRT1的表達

Figure 7.The expressions of ZO-1 and MLCP in the H5V cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs H/R group；△P＜0.05 vs Que+H/R group.圖7 Western blot檢測H5V細胞ZO-1和MLCP蛋白的表達

EX527是公認的SIRT1的抑制劑，為了驗證槲皮素抑制炎癥因子釋放的作用是否與SIRT1有關，本研究用EX527抑制了SIRT1的表達，當EX527使SIRT1表達被抑制后，槲皮素降低上述因子含量的作用顯著減弱。以上結(jié)果說明槲皮素抑制I/R損傷時的炎癥反應減輕微血管損傷，抑制炎癥細胞在微血管內(nèi)聚集的現(xiàn)象與SIRT1的上調(diào)部分相關，但具體機制還需進一步研究。

ZO-1是第一個被發(fā)現(xiàn)的緊密連接相關的胞質(zhì)蛋白，主要表達在形成緊密連接的內(nèi)皮和上皮細胞內(nèi)，并將跨膜縫隙連接蛋白結(jié)合于肌動蛋白細胞骨架上，所以ZO-1的減少會導致屏障通透性的增高［11-12］。MLCP會使肌球蛋白輕鏈去磷酸化，從而抑制肌動蛋白（actin）與肌球蛋白（myosin）之間的橫橋移動［13］。而actin-myosin的收縮力可拉動鄰近細胞彼此分離（回縮），導致細胞間縫隙的形成，增加屏障的通透性［14］。

Figure 8.The tight junction protein ZO-1 in the endothelial cells was detectecd by immunofluorescence staining.The scale bar=20 μm.圖8 免疫熒光檢測內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白ZO-1的表達

Figure 9.F-actin arrangement was revealed by phalloidin staining.The scale bar=50 μm.圖9 鬼筆環(huán)肽染色檢測細胞微絲骨架形態(tài)

為了進一步探討槲皮素降低血管通透性的作用機制，本實驗用Western blot法檢測了槲皮素對H/R內(nèi)皮細胞ZO-1與MLCP表達的影響，同時以免疫熒光的方法觀察了ZO-1在細胞的表達情況以及細胞骨架的排列。結(jié)果顯示H/R后，ZO-1與MLCP表達顯著降低，槲皮素干預后ZO-1與MLCP表達量均明顯回升，而用EX527抑制SIRT1的表達后，沒有出現(xiàn)ZO-1與MLCP表達量回升的現(xiàn)象。鬼筆環(huán)肽是從毒蕈類鬼筆鵝膏中得到的有毒環(huán)狀七肽，用熒光物質(zhì)標記的鬼筆環(huán)肽可特異的與真核細胞的F-actin結(jié)合，從而顯示微絲骨架在細胞中的分布。細胞骨架染色結(jié)果顯示，H/R誘導損傷后，H5V細胞的actin排列紊亂，極性消失，細胞間縫隙增大。槲皮素干預后，actin恢復規(guī)則排列，而用EX527抑制SIRT1的表達后，其排列與H/R組比較，無顯著改善。以上結(jié)果提示槲皮素通過修復內(nèi)皮細胞間的縫隙連接降低H/R內(nèi)皮細胞屏障的通透性，該作用可能與SIRT1有關。但是本實驗尚未探索SIRT1是通過何種分子機制調(diào)節(jié)ZO-1與MLCP功能的，這將在今后的研究中逐漸揭示。