硫化氫通過抑制蛋白激酶B過度磷酸化延緩內皮細胞衰老*

宋志明，余舒杰，焦 潔，楊美玲，李平平，李方敏，錢孝賢△

（1河南大學第一附屬醫院心血管內科，河南開封475001；2中山大學附屬第三醫院心血管內科，廣東廣州510630）

最新發布的《中國心血管病報告2018》顯示，心血管疾病仍是我國城鄉居民死亡原因的首位因素，遠遠高于腫瘤等其它疾病。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）在2002～2016年仍呈持續上升的趨勢，僅2017年大陸地區冠心病介入治療總數就超過了75萬例，給患者家庭、社會以及國家社保帶來了巨大的經濟負擔［1］。

血管內皮細胞功能障礙是公認的冠心病發生的始動因素，更是其發展的主要促動因素［2］。研究發現隨著年齡的增長，冠心病發病率也逐漸增加，證實了與增齡相關的內皮細胞衰老促進了血管事件的發生。因此，如何逆轉或減輕內皮細胞衰老成為治療動脈粥樣硬化的一個臨床難點，也成為冠心病防治的一個關鍵點。

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是繼CO和NO后在人體內發現的第3個氣體信號分子。新近的大量研究也已證實了它在維持心血管系統功能中發揮了重要作用［3-4］。本研究旨在觀察外源性H2S對H2O2誘導的內皮細胞衰老的作用，并進一步探討其可能的作用機制。

材料和方法

1 材料

H2O2、MTT、NaHS和DMSO購自Sigma-Aldrich；Ⅰ型膠原酶購自Invitrogen；無血清培養基（serum free medium，SFM）、M199培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Gibco；內皮細胞生長添加劑購自BD；預染蛋白條帶標志物購自Fermentas；抗Akt抗體、抗磷酸化Akt（p-Akt）抗體購自Cell Signaling Technology；抗血漿纖溶酶原激活物抑制劑1（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）抗體購自 Santa Cruz；抗GAPDH內參照抗體購自Proteintech；抗小鼠及兔Ⅱ抗購自武漢博士德；衰老染色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；細胞裂解液和蛋白定量（BCA法）試劑盒購自南京凱基。

2 方法

2.1 細胞的分離培養 本研究采用原代人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）進行實驗，其分離培養參見既往文獻報道［4-5］。若無特殊交代，研究所用細胞均為1～3代。本研究經河南大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，符合Helsinki原則。相差倒置顯微鏡下，HUVECs貼壁單層生長，呈短梭狀或鋪路石樣排列，細胞為扁平多角形，邊界清楚，胞漿豐富。本實驗對分離培養的第1代內皮細胞標志分子CD31進行了流式細胞法測定。結果顯示，細胞CD31陽性率為99.9%。

2.2 內皮細胞衰老模型的建立 內皮細胞在6孔板內生長至70%時，加入60 μmol/L的H2O2培養1 h［6］，此后換成正常培養基繼續培養24 h。通過衰老相關β半乳糖苷酶（senescence associated β-galactosidase staining，SA-β-Gal）染色和衰老標志物PAI-1的檢測判斷模型成功與否。衰老相關β半乳糖苷酶染色參照既往方法進行［6］。PAI-1的檢測方法參見Western blot部分。

2.3 Western blot實驗 蛋白提取過程參照既往研究［4］，每孔加 50～60 μL 細胞裂解液，放于冰上孵育15 min，將細胞裂解物轉入1.5 mL離心管，13 200 r/min、4oC離心15 min；吸取上清，分裝保存于-80oC冰箱備用。蛋白經BCA定量，總蛋白進行SDSPAGE，轉移到NC膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入相應抗體，4oC搖床上過夜孵育；棄去Ⅰ抗，1×TBST洗3次，加入抗小鼠或兔Ⅱ抗，室溫孵育1 h后，TBST洗3次，ECL顯影，最后用Quantity One軟件分析蛋白條帶。

3 統計學處理

通過SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（mean±SD）表示。均數間比較采用t檢驗或單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 H2O2誘導的HUVECs衰老模型

內皮細胞生長至70%時，加入60 μmol/L的H2O2培養1 h，換液后繼續培養24 h。結果發現與空白對照組相比H2O2組的細胞生長緩慢，形態扁平，PAI-1蛋白表達大幅度增加，SA-β-Gal染色陽性細胞增加（P＜0.05），見圖1。

2 NaHS對H2O2誘導的內皮細胞衰老的影響

我們前期研究發現，100 μmol/L NaHS能夠明顯延緩高糖誘導的內皮細胞衰老［4-5］。因此，在本課題中我們繼續選用100 μmol/L NaHS進行研究。當內皮細胞生長至60%時給予NaHS預處理1 h，之后再用H2O2誘導細胞衰老。結果發現，與H2O2組相比，NaHS組PAI-1的表達明顯降低，SA-β-Gal陽性細胞的比例也顯著減少（P＜0.05），見圖2。

3 NaHS對于衰老內皮細胞Akt磷酸化的影響

細胞衰老的過程是借由信號轉導通路實現的，而且不只是一種途徑，其中Akt起到了重要作用。因此，我們對內皮細胞衰老誘導過程中不同時點Akt的活性進行了檢測。Western blot檢測結果提示，Akt的磷酸化水平在衰老誘導過程中較基礎水平持續升高，其中H2O2處理3 h后的磷酸化水平最高，見圖3。

Figure 1.Premature senescence was induced by H2O2（60 μmol/L）treatment.A：the results of Western blot for determining protein level of PAI-1；B：the ratio of SA-β-Gal positive cells was calculated on 400 cells per group.Senescent cells were stained with blue color（×100）.Mean±SD.n=3～4.*P＜0.05 vs control group.圖1 H2O2誘導的早熟型衰老模型鑒定

Figure 2.The effect of NaHS（100 μmol/L）on H2O2（60 μmol/L）-induced senescence in HUVECs.A：the results of Western blot for determining the protein levels of PAI-1；B：the ratio of SA-β-Gal positive cells was calculated on 400 cells per group（×100）.Mean±SD.n=3～4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs H2O2group.圖2 NaHS對H2O2誘導的內皮細胞衰老的影響

我們進一步采用NaHS預處理1 h、H2O2處理3 h的細胞模型來檢測內皮細胞Akt的磷酸化水平，從而探究NaHS是否通過調節Akt活性而減輕內皮細胞衰老，結果提示，NaHS能夠降低H2O2誘導的Akt磷酸化水平，見圖3。

4 抑制Akt磷酸化對于H2O2誘導內皮細胞衰老的影響

為明確Akt磷酸化在H2O2誘導的內皮細胞衰老中的作用，我們運用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002進行研究。首先，我們檢測不同濃度的LY294002及H2O2處理細胞3 h后Akt磷酸化程度，發現10 μmol/L、30 μmol/L及50 μmol/L LY294002均可明顯抑制Akt磷酸化，見圖4A。此后的研究我們選用 30 μmol/L LY294002 濃度。與 H2O2組比較，30 μmol/L LY294002組SA-β-Gal染色陽性細胞比例顯著下降，PAI-1蛋白表達明顯減 少（P＜0.05），見圖4。

討 論

本研究發現在H2O2誘導內皮細胞衰老中，Akt活性較基礎水平持續升高；而NaHS能夠通過抑制Akt的活化而部分延緩內皮細胞衰老。

Figure 3.The phosphorylation of Akt treated with H2O2（60 μmol/L ）in different time points or pretreatment of NaHS（100 μmol/L）in HUVECs.Mean±SD.n=3～4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs H2O2group.圖3 內皮細胞衰老過程中Akt磷酸化水平變化及NaHS對其的影響

Figure 4.The effect of LY294002 on senescence in HUVECs.A：dose-dependent inhibition of Akt activation by LY294002；B：the ratio of SA-β-Gal positive cells was calculated on 400 cells per group（（×100）；C：the results of Western blot for determining the protein levels of PAI-1 and normalized analysis of the intensity.Mean±SD.n=3～4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs H2O2group.圖4 LY294002對H2O2誘導的內皮細胞衰老的影響

越來越多的研究證實，內皮細胞衰老是冠狀動脈粥樣硬化發病的重要因素，它啟動并參與了其發生和發展整個過程［7］。首先，衰老細胞通過分泌相關細胞因子和表面受體介導單核細胞進入細胞壁從而促發斑塊形成；衰老的內皮細胞更傾向于凋亡，導致內膜功能受損，這樣氧化性低密度脂蛋白就能進入血管壁。然后，衰老細胞分泌的細胞因子如單核細胞趨化因子和白細胞介素參與斑塊的進展。最后，衰老細胞誘發斑塊的不穩定或形成易損斑塊，從而造成急性心血管事件的發生。

內皮細胞衰老分為復制性衰老和早熟型衰老。許多的刺激因素，如過氧化氫、高糖、高脂等均可以誘導內皮細胞早熟型衰老［4-6］。本研究中采用60 μmol/L H2O2誘導細胞衰老，模型成熟、穩定［6］。同時，運用原代人臍靜脈內皮細胞作為研究對象，更貼近人體生理環境。

蛋白激酶B，又稱為Akt，在細胞存活和凋亡中起重要作用。Akt增加細胞活性氧簇的產生，同時抑制細胞內活性氧簇的清除，進而促進或加速復制性及早熟型衰老。內皮細胞相關研究中，降低Akt磷酸化能夠通過P53/P21途徑延長細胞壽命［8］。有研究發現，12周高脂飲食可誘導小鼠血管衰老，而這與持續活化的Akt有關，而Akt基因敲除的小鼠血管衰老程度明顯減輕［9］。在另外的研究中發現，內皮細胞衰老過程中Akt活性增高，但是進一步提高其活性也能夠延緩衰老，考慮其能增強內皮型一氧化氮合酶活性有關［10］。與此前研究結果一致，我們的研究也發現在H2O2誘導內皮細胞衰老過程中，Akt的活性較基礎水平持續升高，而應用LY294002預處理特異性抑制Akt活性能延緩細胞衰老。

H2S是人體內發現的第3種內源性氣體信號分子。在我們前期的研究中已經證實，它能夠延緩高糖誘導的內皮細胞衰老［4-5］。已有研究報道提示外源性H2S通過Sirt1通路部分逆轉過氧化氫誘導的內皮細胞衰老［11］。本研究證實H2S可以抑制Akt的活化，延緩內皮細胞衰老。

本研究結果提示，H2S能通過抑制Akt活化，部分性抵抗H2O2誘導的HUVECs衰老。Akt活性的調節或許可成為防治年齡相關性心血管疾病的治療靶點。