低氧下K562細胞向紅系分化進程中GATA-1與miR-451a表達的相關性研究*

付成冰，劉 芳，牛志鵬，胡彩艷

（青海大學醫學院 1高原醫學研究中心，2生物化學教研室，青海西寧810000）

GATA結合蛋白1（GATA binding protein-1，GATA-1）是調控紅系分化過程不可或缺的轉錄因子［1］，它可通過調節微小 RNA（microRNA），如 microRNA-451a（miR-451a），實現對紅系分化的精細調控。miR-451a主要富集在成熟紅細胞內［2-3］，其在紅系的表達水平明顯高于其它鏈系，且隨著紅系分化過程持續升高［4］，動物和體外紅系分化模型均證實miR-451a有助于紅細胞成熟［5-6］，提示miR-451a是調控紅系分化的特異性microRNA。

低氧環境能促進骨髓造血干細胞向紅系定向分化，結果使骨髓紅系前體細胞增多［7-8］。低氧條件下大鼠骨髓CD71+細胞內GATA-1的表達顯著高于對照組，表明低氧能誘發GATA-1的高表達［9］。然而，低氧條件下GATA-1與miR-451a的相關性及其在紅系分化過程中的作用還不明確。本項工作以低氧條件下人慢性髓細胞性白血病K562細胞紅系分化模型為研究對象［10］，檢測GATA-1和miR-451a在低氧下表達的變化趨勢，并分析兩者表達的相關性，為闡釋GATA-1可能通過調控miR-451a參與促進低氧下紅細胞分化過程提供實驗依據。

材料和方法

1 試劑與儀器

K562細胞購自中國科學院上海細胞研究所。RPMI-1640培養液購自HyClone；胎牛血清購自四季青公司；氯化血紅素（hemin chloride）購自北京索萊寶科技有限公司；總RNA提取試劑盒（DP419）、miRNA提取試劑盒（DP501）、miRNA逆轉錄試劑盒（KR211-02）和miRNA熒光定量PCR試劑盒（208054）均購自TIANGEN；RNA逆轉錄試劑盒（K1622）、BCA蛋白定量試劑盒和RNA熒光定量試劑盒（160025891）購自Thermo Fisher Scientific；兔抗人GATA-1單克隆抗體（ab181544）和α-tubulin鼠單克隆抗體購自Abcam；山羊抗兔IgG（SA00001-2）購自 Proteintech；CD235a流式抗體 APC-Cy7（349116）和同型抗體（400230）購自BioLegend。所用引物均由上海生工生物技術公司合成，序列見表1。GATA-1過表達慢病毒（LV-GATA1，記為Up）和GATA-1過表達陰性對照慢病毒（LVCON238，記為NC-Up）、GATA-1干擾慢病毒［LV-GATA1-RNAi，記為Down］和GATA-1干擾陰性對照慢病毒（LVCON077，記為NC-Down）均購自上海吉凱基因科技有限公司。三氣培養箱（Binder）；熒光顯微鏡（Zeiss）；PCR擴增儀（Eppendorf）；7500型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）；流式細胞儀（Beckman）；Amersham Imager 600化學發光成像分析儀（GE Healthcare）。

2 方法

2.1 細胞培養及分化模型的建立 K562細胞培養于含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養液中，分為低氧（hypoxia）組和常氧（normoxia）組，以 5×107/L 的密度分別置于低氧（37℃、1%O2、94%N2、5%CO2、飽和濕度）和常氧（37℃、5%CO2、飽和濕度）培養箱。采用40 μmol/L hemin chloride誘導K562細胞分化至48和72 h。

2.2 Western blot檢測GATA-1核蛋白的表達 提取細胞核蛋白，BCA法定量后取5 μg核蛋白進行10%SDS-PAGE；轉膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育GATA-1抗體（1∶10 000）過夜；0.1%TBST清洗后，加II抗（1∶10 000），室溫封閉1 h，洗膜、顯影曝光。以α-tubulin為內參照，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/α-tubulin條帶灰度值。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.3 RT-qPCR檢測γ-globin和GATA-1 mRNA及miR-451a的表達

2.3.1 γ-globin和GATA-1 mRNA表達的檢測 提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，以β-actin為內參照，采用2-ΔΔCt方法檢測γ-globin和GATA-1的mRNA表達。擴增參數為：95℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環。每個樣本重復3次。

2.3.2 miR-451a表達的檢測 提取細胞總miRNA，以Oligo（dT）18為引物逆轉錄成cDNA。以U6為內參照，采用2-ΔΔCt方法檢測miR-451a的表達。擴增參數為：95℃ 15 min；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個循環。每個樣本重復3次。

2.4 慢病毒感染 將對數生長期的K562細胞以5×107/L的密度接種于6孔板，取Up［滴度4×1011TU/L，感染復數（multiplicity of infection，MOI）=30］和NCUp（滴度 1×1012TU/L，MOI=30）感染 K562細胞，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養12 h后補加1 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，培養至96 h，熒光顯微鏡下觀察病毒載體中插入的GFP表達情況。Down（滴度4×1011TU/L，MOI=30）和NC-Down（滴度1×1012TU/L，MOI=30）的感染方法同上。

2.5 流式細胞術檢測CD235a的表達 CD235a，又稱血型糖蛋白A（glycophorin A，GPA），是紅系細胞表面特異性標志物，其表達量隨紅系分化逐步增高［11］。收集誘導后的細胞，用預冷的PBS清洗2遍，以1×1010/L重懸細胞。取100 μL細胞懸液加入5 μL CD235a抗體，室溫避光孵育15 min。PBS清洗后，棄上清，用500 μL PBS重懸細胞，上機檢測。

2.6 細胞染色

2.6.1 聯苯胺染色 收集細胞，離心棄上清，用PBS清洗2遍后，500 μL PBS重懸。加聯苯胺染液15 μL，3%H2O210 μL，3 min后加1 μL硝普鈉溶液。取10 μL細胞懸液均勻在載玻片上，每個視野下大約200個細胞，計算陽性細胞百分比。未分化的細胞不著色，分化的細胞呈深藍色。

2.6.2 瑞氏-吉姆薩染色 將收集的細胞均勻涂抹在載玻片上，滴加染液A（0.8～1.0 mL）覆蓋整個涂抹區域，染色1 min；再滴加染液B（體積是A液的2～3倍），用吸耳球吹勻，染色約10 min。沖洗殘存染液，晾干后鏡下觀察并進行圖片采集。

3 統計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，各組數據均用均數±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，采用Spearman進行相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 K562細胞紅系分化模型的復制

RT-qPCR結果顯示，常氧組γ-globin的mRNA表達在48 h與0 h相比無顯著性差異（P＞0.05），低氧組48 h其表達量顯著高于0 h（P＜0.05）；兩組γ-globin的mRNA表達在72 h表達均顯著增高（P＜0.05），并且在72 h低氧組顯著高于常氧組（P＜0.05），見圖1A。與0 h相比，兩組細胞聯苯胺染色陽性率均顯著升高（P＜0.05），且48和72 h低氧組聯苯胺染色陽性率均顯著高于常氧組（P＜0.01），見圖1B。與0 h相比，兩組細胞表面CD235a在48 h時表達均顯著升高（P＜0.05）；72 h低氧組CD235a的表達顯著高于常氧組（P＜0.01），見圖1C。

2 GATA-1和miR-451a的表達

Western blot檢測結果顯示，48 h低氧組GATA-1蛋白的表達量與常氧組相比無顯著差異（P＞0.05），72 h低氧組GATA-1蛋白的表達量顯著高于常氧組（P＜0.05）；組內比較結果顯示，低氧組GATA-1蛋白的表達量在72 h顯著高于48 h（P＜0.05），常氧組GATA-1蛋白的表達量在48和72 h無顯著差異（P＞0.05），見圖2A。RT-qPCR結果顯示，低氧組GATA-1 mRNA的表達量在72 h較48 h顯著升高（P＜0.05），且顯著高于常氧組（P＜0.05），常氧組在48和72 h無顯著差異（P＞0.05），見圖2B。miR-451a在低氧組72 h時表達顯著增高（P＜0.05），且顯著高于常氧組（P＜0.05），常氧組miR-451a的表達在48和72 h無顯著差異（P＞0.05），見圖2C。

Figure 1.The erythroid differentiation model of K562 cells was replicaed.A：the mRNA expression of γ-globin was detected by RT-qPCR；B：the positive cells of benzidine staining at 48 h and 72 h（scale bar=100 μm）；C：the expression of erythroid specific marker，glycophorin A（CD235a），was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normoxia group；#P＜0.05 vs 0 h.圖1 K562細胞向紅系分化模型的復制

3 低氧條件下GATA-1和miR-451a表達的相關性分析

相關性分析結果顯示，低氧組GATA-1的mRNA表達與miR-451a的表達呈正相關，相關系數為r=0.850（P＜0.01），見圖3。

4 低氧條件下過表達或干擾GATA-1的表達對紅系分化的影響

4.1 過表達GATA-1可促進紅系分化 與光學顯微鏡同一視野相比，熒光倒置顯微鏡顯示，Up組90%以上細胞呈綠色熒光，見圖4。Western blot檢測過表達后GATA-1的表達量，結果顯示，Up組出現雙條帶且表達量顯著高于NC-Up組（P＜0.05），見圖5。低氧下Up組γ-globin的表達在48和72 h均顯著高于NC-Up組，見圖6A。同時，聯苯胺染色結果也顯示GATA-1過表達可顯著增加聯苯胺陽性率（P＜0.05），見圖6B。流式細胞術結果顯示，低氧誘導72 h后Up組細胞表面CD235a的表達顯著高于NC-Up組（P＜0.05），見圖6C。細胞形態實驗結果顯示，Up組在48和72 h時體積增大、核偏移和核縮小的細胞數目均顯著多于NC-Up組（P＜0.01），見圖6D。

Figure 2.Expression of GATA-1 and miR-451a in the two groups.A：the protein expression of GATA-1 in the nucleus detected by Western blot（N：normoxia；H：hypoxia）；B：the mRNA expression of GATA-1 detected by RT-qPCR；C：the expression of miR-451a detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normoxia group；#P＜0.05 vs 48 h.圖2 GATA-1和miR-451a在兩組細胞中的表達

Figure 3.Correlation analysis between GATA-1 and miR-451a under hypoxia.圖3 GATA-1與miR-451a在低氧條件下的相關性分析

Figure 4.The fluorescence detection of GATA-1 over-expression lentivirus 96 h after infection（scale bar=50 μm）.A，B：NC-Up group；C，D：Up group.A，C：light microscopy；B，D：fluorescence microscopy.圖4 GATA-1過表達慢病毒感染96 h后的熒光檢測

Figure 5.The protein expression of GATA-1 in UP group and NC-Up group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC-Up group.圖5 過表達慢病毒感染后GATA-1蛋白表達的檢測

Figure 6.GATA-1 over-expression enhanced erythroid differentiation of the K562 cells under hypoxia condition.A：the relative mRNA expression of γ-globin detected by RT-qPCR；B：the results of benzidine staining（scale bar=100 μm）；C：the expression of CD235a detected by flow cytometry；D：the results of Wright-Giemsa staining（scale bar=10 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC-Up group.圖6 低氧下過表達GATA-1后促進紅系分化

4.2 干擾GATA-1可抑制紅系分化 與光學顯微鏡同一視野相比，熒光倒置顯微鏡顯示，Down組大于90%的細胞呈綠色熒光，見圖7。Western blot檢測干擾后GATA-1的表達量，Down組顯著低于NC-Down組（P＜0.05），見圖 8。與NC-Down組相比，低氧下Down組γ-globin mRNA的表達水平在72 h顯著降低（P＜0.05），見圖9A。聯苯胺染色結果也顯示干擾GATA-1可顯著降低聯苯胺陽性率（P＜0.05），見圖9B。流式細胞術結果顯示，Down組在誘導72 h后細胞表面的CD235a表達水平顯著低于NC-down組（P＜0.05），見圖9C。細胞形態實驗結果顯示，與NCDown組相比，Down組在72 h時體積增大、核偏移和核縮小的細胞數目顯著減少（P＜0.01），見圖9D。

Figure 7.The fluorescence detection of GATA-1 knock-down lentivirus 96 h after infection（scale bar=50 μm）.A，B：NC-Down group；C，D：Down group.A，C：light microscopy；B，D：fluorescence microscopy.圖7 GATA-1干擾慢病毒感染96 h后熒光檢測

5 低氧條件下過表達或抑制GATA-1后miR-451a的表達檢測

5.1 過表達GATA-1可促進miR-451a表達 RT-qPCR檢測GATA-1過表達后miR-451a的表達，結果顯示，低氧下誘導48 h后Up組miR-451a的表達量與NC-Up組相比無顯著差異（P＞0.05），72 h時Up組miR-451a的表達量顯著高于NC-Up組（P＜0.05），見圖10。

5.2 干擾GATA-1可抑制miR-451a表達 RT-qPCR檢測GATA-1抑制后miR-451a的表達，結果顯示，低氧下誘導48 h后Down組miR-451a的表達量與NCDown組相比無顯著差異（P＞0.05），72 h時Down組miR-451a的表達量顯著降低（P＜0.05），見圖11。

討 論

Figure 8.The protein expression of GATA-1 in Down group and NC-Down group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCDown group.圖8 干擾慢病毒感染后GATA-1蛋白表達的檢測

GATA-1作為紅系核心轉錄因子，主要通過靶向激活β-珠蛋白基因［12］、促紅細胞生成素及其受體（erythropoietin/erythropoietin receptor，Epo/EpoR）［13］和microRNAs等的表達，促進紅系分化。miR-451a的表達受GATA-1調控。在K562細胞紅系分化模型中，GATA-1可激活miR-144/451基因簇上游區164 bp、570 bp和1 281 bp三個保守位點［14］，促進 miR-451表達。在人的17號染色體上，GATA-1可結合miR-144/451基因簇上游3.8 kb位點，激活RNA聚合酶Ⅱ對miR-451的轉錄［15］。利用基因芯片技術比較紅系分化中miRNAs表達譜和GATA-1缺失的原紅細胞系G1E在GATA-1恢復后miRNA的表達，顯示miR-451a在正常紅系分化過程中表達逐漸上調，且受到GATA-1的正向調控［16］，表明GATA-1正向調控miR-451具有促紅系分化作用。鼠的胚胎干細胞過表達miR-451a后，其細胞內血紅蛋白含量增高并伴有細胞表面 CD235a和TER-119 表達升高［5］，提示miR-451過表達能促進鼠胚胎干細胞向紅系分化。miR-451在臍血來源的CD34+造血干祖細胞紅系分化的早期階段開始表達，持續到晚幼紅階段并處于高表達，其可作用于GATA-2的3′-非翻譯區（3′-untranslated region，3′-UTR），下調GATA-2的表達繼而促進紅細胞成熟［17-18］。研究顯示，低氧下GATA-1表達增高。利用質譜分析大鼠NRK-49F細胞在低氧下核蛋白表達變化時，顯示GATA-1的表達顯著增高［19］，提示GATA-1受低氧調控。低氧下肺泡II型細胞內GATA-1表達顯著升高，誘導血紅蛋白表達升高［20］。進一步研究證實，低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）在低氧下可上調K562細胞和CD34+細胞內GATA-1的表達，促進紅系分化［21］，滿足細胞在低氧下的需氧要求。本實驗結果也顯示，低氧組K562細胞中GATA-1的表達隨誘導時間延長顯著增加并且在72 h其表達量顯著高于常氧組。但miR-451a在低氧下是否影響紅系分化鮮有報道。本研究結果顯示，miR-451a的表達雖然在常氧組48 h和72 h無顯著變化，但在低氧組其表達顯著增加且表達量在72 h時顯著高于常氧組，提示低氧能夠誘導miR-451a表達促進紅系分化。但GATA-1對miR-451a的調控關系在低氧下紅系分化過程中的作用還不清楚。

Figure 9.GATA-1 knock-down inhibited erythroid differentiation of the K562 cells under hypoxia condition.A：the relative expression of γ-globin detected by RT-qPCR；B：the results of benzidine staining（scale bar=100 μm）；C：the expression of CD235a detected by flow cytometry；D：the results of Wright-Giemsa staining（scale bar=10 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC-Down group.圖9 低氧下干擾GATA-1后抑制紅系分化

Figure 10.GATA-1 over-expression increased the expression of miR-451a under hypoxia.The expression of miR-451a was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC-Up group.圖10 低氧下過表達GATA-1可促進miR-451a表達

Figure 11.GATA-1 knock-down decreased the expression of miR-451a under hypoxia.The expression of miR-451a was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC-Down group.圖11 低氧下干擾GATA-1可抑制miR-451a表達

依據文獻報道，本課題組復制低氧下K562細胞紅系分化模型。γ-globin和CD235a的表達均表現為隨誘導時間延長顯著增加，表明低氧K562細胞紅系分化模型復制成功。低氧組γ-globin的mRNA表達顯著高于常氧組，這一結果與Kaneko等［22］研究結果相符合。利用聯苯胺染色法檢測血紅蛋白的表達可用來評價紅系分化程度［23］。聯苯胺染色結果顯示低氧組細胞陽性率顯著高于常氧組，與γ-globin結果相一致，說明低氧有助于γ-globin表達。GATA-1與miR-451a間的相關性分析表明，低氧組GATA-1與miR-451a呈現正相關關系，提示低氧下GATA-1與miR-451a之間的正相關性與K562細胞紅系分化有關。采用慢病毒感染實驗驗證其相關性。低氧下GATA-1過表達能夠增強紅系分化指標的表達，同時瑞氏-吉姆薩染色作為分析紅細胞典型特征變化的方法［24］，其結果顯示Up組體積增大、核偏移和核縮小的細胞數目比NC-Up組顯著增多，提示低氧下GATA-1過表達有利于K562細胞紅系分化。低氧下干擾GATA-1表達可減弱紅系分化指標的表達，同時瑞氏-吉姆薩染色顯示Down組體積增大、核偏移和核縮小的細胞數目顯著減少，提示低氧下干擾GATA-1表達能抑制紅系分化。低氧下過表達GATA-1后miR-451a在72 h顯著高于對照組，而干擾GATA-1后miR-451a在72 h顯著低于對照組，提示低氧下GATA-1可正向調控miR-451a的表達。

綜上所述，本研究通過K562細胞紅系分化模型，分析低氧下GATA-1與miR-451a的表達情況和相關關系，提示低氧可誘導GATA-1表達增高，進而加強miR-451a的表達，這種正相關關系參與低氧促紅系分化過程。