MRTF-A誘導自噬從而緩解腦缺血再灌注大鼠皮層神經細胞損傷*

李 翔，張 玲，賈 粵，李 楨，趙玉潔，馬 蘭，李瑞雯，李 力，曹曉璐△

（1武漢科技大學醫學院公共衛生學院環境衛生與職業醫學教研室，職業危害識別與控制湖北省重點實驗室，湖北武漢430081；2武漢科技大學附屬普仁醫院病理科，科教部，湖北武漢430081）

腦卒中是嚴重危害人類健康的疾病，2018年我國現患腦卒中病人約1300萬，而缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）占60%～70%［1］。目前，針對CIS的治療手段主要是在有效時間窗內實施溶栓治療，盡快恢復血供以防止缺血區域擴散［2］。一旦超過有效時間窗，可能導致腦細胞不可逆損傷甚至死亡，發生缺血性腦卒中再灌注（cerebral ischemic stroke-reperfusion，CIS/R）損傷，危及生命［3-4］。CIS/R損傷的發生機制如何？是否能有效防止病程發展至CIS/R期？為此本研究探討了CIS/R損傷的機制，為尋找有效的治療方法提供科學依據。

SAP蛋白家族的心肌素相關轉錄因子A（myocardin-related transcription factor-A，MRTF-A）由 807個氨基酸殘基組成，是血清反應因子（serum response factor，SRF）的輔助激活因子，在腦組織中表達并參與基因轉錄調控［5］。研究表明，通過組蛋白乙?；揎?，MRTF-A可抑制缺血再灌注介導的神經細胞凋亡，但其具體分子機制并未完全闡明［6］。本研究擬在整體動物水平，檢測腦缺血再灌注誘導的神經細胞損傷時，MRTF-A對神經細胞凋亡和自噬的影響及相關蛋白的表達調控，初步探討MRTF-A抑制大鼠腦缺血再灌注損傷的保護機制。

材料和方法

1 動物及處理方法

6周齡SPF級雄性SD大鼠，體重250～300 g，購自三峽大學實驗動物中心，許可證號為SCXK（鄂）2018-0045。室溫、常規大鼠飼料喂養，動物自由飲水。采用大腦中動脈栓塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血2 h再灌注24 h建立腦缺血再灌注模型［7］。采用隨機數字表法將90只SD大鼠隨機分成3組：假手術組（sham組）30只、模型組（MCAO/R組）30只和實驗組（Lv+MCAO/R組）30只。假手術組和模型組注射慢病毒空載體，實驗組注射MRTF-A高表達慢病毒，注射7 d后假手術組和實驗組先各隨機抽取5只大鼠用于驗證MRTF-A是否成功高表達，其余模型組和實驗組大鼠構建腦缺血再灌注模型，假手術組實施手術但不插線栓。

2 主要試劑與器材

MRTF-A高表達慢病毒由上海吉凱基因技術有限公司設計合成；小鼠抗MRTF-A單抗（SC-390324）購自Santa Cruz；小鼠抗β-actin單抗（BM0627）購自BOSTER；兔抗beclin-1單抗（ab207612）購自Abcam；兔抗LC3-I和LC3-II單抗（AF5402）購自AFFINITY；兔抗Bcl-2單抗（bsm-52023R）、小鼠抗Bax單抗（bsm-33283M）和兔抗LC3多抗（bs-8878R）購自BIOSS；山羊抗兔、抗鼠Cy3購自Solarbio；TUNEL試劑盒（MA0223）購自Meilunbio。腦立體定位儀（江蘇賽昂斯生物技術有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，FV1000）；透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）由中國科學院武漢病毒研究所分析測試中心提供。

3 主要方法

3.1 MCAO再灌注損傷模型的構建 將直徑0.23 mm尼龍線一端反復浸入熔化的石蠟5次，待尼龍線表面石蠟凝固后即制作成栓線備用。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3.5 mL/kg），仰臥固定于手術臺上，取頸部正中切口，剪開筋膜，鈍性分離右側胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露右側頸總動脈（common carotid artery，CCA）和迷走神經并分離。沿著右側頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內動脈（internal carotid artery，ICA）分叉，分離ECA和ICA，結扎ECA。用動脈夾夾住CCA和ICA，在ECA距動脈分叉5 mm處用眼科剪剪一小口，將栓線緩慢向ICA插入，至ICA與ECA交叉處時，去掉ICA動脈夾，調整插線角度，繼續將線栓緩慢向ICA入顱方向推進，插入深度（18.0±0.5）mm為止。將栓線與ECA結扎固定，松開CCA動脈夾，剪除線栓多余末端，最后縫合筋膜、皮膚。缺血2 h之后，抽出線栓，結扎ECA近分叉端，假手術組除不插線外，其余手術步驟同模型組。

3.2 腦室注射慢病毒及免疫熒光驗證MRTF-A的高表達 實驗組大鼠麻醉后，固定于腦立體定位儀上，在右側腦室注射2 μL Lv-MRTF-A，滴度為8×1011TU/L（TU：transduction unit），注射位點為囟點后1.72 mm，矢狀縫旁開2 mm，深2.6 mm處。慢病毒注射7 d后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，打開胸腔，用4%多聚甲醛心臟灌流固定15 min，取出腦組織后繼續在4%多聚甲醛中浸泡24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片。用免疫熒光法驗證慢病毒注射后是否成功高表達MRTF-A，在此基礎上構建腦缺血再灌注模型。

3.3 神經功能評分和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色 缺血再灌注24 h后，對大鼠進行神經行為學變化觀察，根據Longa’s 5分法評價大鼠神經功能。活動正常，無神經功能缺損；左前肢不能完全伸展為1分；爬行時向左側轉圈為2分；爬行時向左側傾倒為3分；不能自發行走，意識喪失為4分。實驗中將評分1～4分大鼠納入研究。術后24 h，將3組大鼠麻醉后取腦，-20℃冷凍30 min，將鼠腦從額極向后連續冠狀切面，約2 mm切一層，將腦片置于1%的TTC溶液中，于37℃避光孵育20 min，再置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，掃描儀掃描獲取圖像，正常腦組織呈鮮紅色，梗死腦組織呈白色。ImageJ軟件測定各腦片白色梗死區域面積，最后計算梗死體積百分率。

3.4 Western blot檢測皮層組織自噬與凋亡相關蛋白的表達 取注射點周圍缺血半暗帶5 mm范圍皮層組織，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制12%的SDS-PAGE分離膠，5%的濃縮膠，50 μg蛋白變性后上樣，跑膠，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育I抗（MRTF-A，1∶2 000；β-actin，1∶500；beclin-1，1∶1 000；LC3-I和LC3-II，1∶2 000；Bcl-2，1∶500；Bax，1∶1 000），4℃過夜，TBST洗I抗3次，加入II抗室溫孵育2 h，TBST洗II抗后加ECL顯影液進行顯影，X線膠片曝光、顯影、定影，沖洗膠片并掃描成像，使用ImageJ軟件進行灰度值分析，以目的蛋白和β-actin的比值進行相對定量。

3.5 TUNEL法分析神經細胞凋亡率聯合免疫熒光檢測LC3蛋白的表達 石蠟切片60℃烤片1 h，二甲苯脫蠟后梯度乙醇復水，Proteinase K工作液37℃恒溫孵育30 min，加入TUNEL反應液，37℃孵育1 h（MCAO/R及Lv+MCAO/R組加入50 μL TdT+450 μL dUTP液；假手術組不加dUTP，僅加入50 μL dUTP液），滴加50 μL FITC液，37℃避光孵育1 h，10%山羊血清封閉30 min，濕盒中孵育I抗（LC3，1∶150）4℃冰箱過夜，孵育II抗（Cy3，1∶200），DAPI核染甘油封片。TUNEL陽性細胞形態多樣化且呈綠色熒光，激光共聚焦顯微鏡下對TUNEL陽性細胞計數并拍照，隨機選取大腦皮層S1HL區缺血半暗帶5個視野用于分析凋亡率及LC3蛋白表達分布。

3.6 TEM觀察神經細胞結構及自噬溶酶體 取大鼠右側大腦皮層S1HL區缺血半暗帶約1 mm×1 mm×1 mm組織，生理鹽水清洗，用2.5%戊二醛二甲砷酸鈉固定液固定2～3 h，二甲砷酸鈉緩沖液洗2次后，在1%四氧化鋨中作后固定、包埋、超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，用TEM觀察神經細胞結構及自噬溶酶體，并拍照記錄。

4 統計學處理

應用SPSS 22.0統計學軟件分析，數據以均數±標準差（mean±SD）表示。兩獨立樣本均數比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時用Bonferroni法進行多重比較，不齊時用Dunnett法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 高表達MRTF-A后神經功能評分及腦梗死體積的變化

假手術組30只大鼠全部存活；模型組造模成功23只，5只死亡，神經功能評分為0的2只舍去，造模成功率為76.67%；實驗組造模成功22只，4只死亡，神經功能評分為0的4只舍去，造模成功率為73.33%。

實驗組慢病毒腦室注射后7 d，MRTF-A熒光表達強度顯著高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1A，在此基礎上構建實驗組MCAO模型。假手術組神經功能評分和腦梗死體積均為0；模型組神經功能評分為2.57±0.20，梗死體積為（31.67±2.73）%；實驗組神經功能評分為1.71±0.18，梗死體積為（12.00±1.16）%，與模型組相比均顯著降低（P＜0.01），見圖1B、C。

Figure 1.The effect of high expression of MRTF-A on cerebral ischemia-reperfusion injury.A：high expression of MRTF-A by lentiviral injection（×400，n=5）；B：neurological function score；C：TTC staining and percentage of cerebral infarction volume.Mean±SD.n=5 in A；n=7 in B and C.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs MCAO/R group.圖1 高表達MRTF-A對腦缺血再灌注損傷的影響

2 腦缺血再灌注損傷對缺血半暗帶神經細胞形態學影響

TEM觀察顯示，假手術組神經細胞核膜完整，為雙層膜結構（圖2A1），核周線粒體嵴紋理、內質網、高爾基體形態清晰排列緊湊（圖2A2），自噬溶酶體少見（圖2A）；模型組神經細胞核膜結構缺損，部分區域呈單層膜結構（圖2B1），線粒體、內質網、高爾基體等細胞器明顯腫脹變形，大量空泡形成（圖2B2），伴隨有自噬溶酶體形成（圖2B）；與模型組相比，實驗組核膜形態恢復為雙層膜結構（圖2C1），線粒體腫脹程度緩解空泡較少，嵴紋理清晰（圖2C2），自噬溶酶體數量進一步增多（圖2C）。

3 腦缺血再灌注損傷后MRTF-A誘導自噬和凋亡相關蛋白表達的變化

Figure 2.Observation of nuclear membrane and organelles of the nerve cells under transmission electron microscope.The red arrows indicate the autophagic lysosomes（A，B and C，×1 700），the yellow arrows indicatethenuclear membrane（A1，B1andC1，×5 000），and the black arrows indicate the mitochondria（A2，B2 and C2，×5 000）.圖2 TEM觀察神經細胞核及周圍細胞器的形態結構

Western blot結果顯示，與假手術組相比，模型組LC3-II/LC3-I比值及beclin-1和MRTF-A蛋白表達量的差異無統計學顯著性（P＞0.05），Bcl-2/Bax比值顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，實驗組LC3-II/LC3-I和Bcl-2/Bax比值及beclin-1和MRTF-A蛋白表達量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。

4 腦缺血再灌注損傷對缺血半暗帶神經細胞凋亡及LC3蛋白表達的影響

TUNEL聯合免疫熒光法結果顯示，假手術組皮層神經細胞核呈圓形飽滿，極少有TUNEL陽性細胞，凋亡率為（3.31±2.72）%，LC3蛋白在神經細胞胞漿中表達，分布均勻呈彌散狀；模型組缺血側皮層神經細胞核體積明顯縮小，染色加深，胞漿及胞核固縮，細胞核形態多樣，含有大量TUNEL陽性細胞，其神經細胞凋亡率為（57.02±11.04）%，與假手術組相比顯著升高（P＜0.01），LC3蛋白在神經細胞中呈現聚集狀；實驗組皮層神經細胞核皺縮較少，細胞核形態多樣化，含有少量TUNEL陽性細胞，凋亡率［（42.10±5.20）%］與模型組相比顯著降低（P＜0.05），LC3蛋白熒光強度與模型組相比顯著升高（P＜0.05），在神經細胞胞漿中聚集更明顯，呈斑片狀，見圖4。

討 論

MRTF-A在腦、心肌等組織中廣泛表達，作為共激活因子與SRF結合形成復合物，作用于靶基因（如即早基因等）的啟動子區域CArG box并激活其轉錄表達，從而調節細胞的生理功能［8］。有研究表明，MRTF-A通過調控ERK/PI3K等信號通路參與細胞增殖、分化及凋亡過程［9-10］。在不同組織器官病理條件下，MRTF-A的作用存在差異。有研究通過敲除MRTF-A或抑制MRTF-A活性，降低巨噬細胞中活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生，顯著減輕缺血再灌注誘導的小鼠急性腎損傷［11］。而我們既往的研究發現，MRTF-A在CIS/R介導的神經損傷早期，具有明顯的抑制神經細胞凋亡的作用［6］，但其具體作用分子機制還有待進一步闡明。

CIS/R損傷是CIS臨床溶栓治療后神經功能恢復的主要障礙，其作用機制與自由基損傷、炎癥反應和腦血管損傷等多種因素有關，可導致腦內屏障系統結構破壞、微血栓形成并最終導致神經細胞死亡［12-14］。本項目研究也發現，在構建大鼠MCAO模型再灌注24 h后，缺血中心區域腦組織出現大面積壞死，壞死組織周圍（缺血半暗帶）神經細胞大量凋亡，核周線粒體腫脹變形、嵴模糊不清、空泡化明顯，部分核膜變為單層，高爾基體、內質網囊泡腫脹碎裂。因此，逆轉缺血半暗帶損傷、減少神經細胞凋亡為CIS/R治療的關鍵。為了驗證MRTF-A可有效抑制CIS/R介導的神經細胞凋亡，本研究在大鼠腦室過表達MRTF-A后構建MCAO再灌注模型，發現缺血側梗死體積顯著減小，缺血半暗帶神經細胞凋亡率明顯下降，雙層核膜和線粒體嵴清晰可見，內質網和高爾基體囊泡完整無碎裂，損傷較輕，說明MRTF-A在CIS/R過程中能有效減少神經細胞損傷和凋亡。據報道，通過維持線粒體的通透性、降低內質網應激作用可明顯減輕CIS/R過程腦組織損傷［15-16］。MRTF-A對CIS/R過程中對神經細胞的保護作用可能也與維持神經細胞內線粒體、內質網等細胞器正常的結構和功能有關。

為了進一步研究MRTF-A的抗神經損傷的相關分子機制，我們檢測了凋亡相關基因Bcl-2和Bax表達水平。Bcl-2與Bax共屬于一個家族，通過控制線粒體膜的通透性來調節凋亡激活物，Bcl-2水平的升高和Bax的降低表明細胞對凋亡的抵抗性增強［17］。我們前期的研究證明，在培養的原代神經細胞中，MRTF-A可通過結合至bcl-2基因啟動子CArG box區域，上調Bcl-2的轉錄活性［18］。在本研究中，CIS/R過程導致神經細胞抵抗凋亡能力顯著降低，Bcl-2/Bax比值顯著下降；而高表達MRTF-A的大鼠在CIS/R發生24 h后，Bcl-2/Bax比值顯著升高了，提示MRTF-A通過激活Bcl-2并抑制Bax通路顯著增強缺血條件下機體對CIS/R介導的凋亡抗性。這也進一步在整體動物水平證明了MRTF-A對抗凋亡基因bcl-2表達的調控作用。

Figure 3.The protein expression of MRTF-A，autophagy-related molecules and apoptosis-related molecules.A：the expression levels of MRTF-A，beclin-1，LC3-I and LC3-II；B：the expression levels of Bcl-2 and Bax.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MCAO/R group.圖3 MRTF-A、自噬相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達情況

自噬是一種高度保守的細胞行為，通過溶酶體降解途徑進行自我吞噬，一般經歷形成吞噬泡、自噬小體和自噬溶酶體3個過程［19］。目前主要認為，自噬是一種細胞自我保護機制，可以有效抵御外界惡劣環境刺激，延緩細胞凋亡，但多度或過快的自噬也會導致自噬性細胞死亡［20］。本研究發現，在生理情況下神經細胞自噬水平較低，MCAO再灌注模型組中，缺血半暗帶區神經細胞自噬溶酶體數量增加，而高表達MRTF-A后的MCAO再灌注后，實驗組神經細胞自噬溶酶體進一步增多，提示MRTF-A增強了CIS/R過程中神經細胞的自噬水平。一項老年大鼠MCAO模型實驗表明，通過慢病毒過表達NMNAT1，激活PI3K/Akt信號通路，可增強神經細胞自噬水平，缺血側腦梗死體積明顯減小［21］。這與我們的研究結果相似，說明增強自噬水平，的確可以減輕CIS/R介導的腦損傷。

自噬發生能促進LC3蛋白脂質化：非激活型胞質LC3（LC3-I）經過水解和脂質化后轉變為激活的自噬小體膜結合的LC3-II［22］。本研究發現，MRTF-A高表達MCAO再灌注模型LC3-II/LC3-I的比值顯著升高，說明此時神經細胞中大量LC3-I向LC3-II轉變，自噬小體形成增加。形態學觀察發現，正常情況下神經細胞LC3在胞漿中均勻分布表達，而造模后LC3發生聚集性改變，且MRTF-A高表達MCAO再灌注模型的LC3蛋白聚集性進一步增加，呈斑片狀改變，這也說明了MRTF-A的確在增強凋亡抵抗力的同時調控了自噬相關基因LC3的表達，從而促進了神經細胞自噬水平。

Figure 4.The effects of high expression of MRTF-A on the nerve cell apoptosis，and LC3 expression and distribution.A：images of TUNEL and immunofluorescence（×400；A1，A2，A3：×1 600）；B：apoptotic rates of the nerve cells；C：fluorescence intensity of LC3 protein.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group.圖4 高表達MRTF-A對神經細胞凋亡及LC3表達分布的影響

已有研究表明，上調beclin-1在哺乳動物細胞中的表達，能夠刺激自噬發生［23］。我們研究發現，MCAO再灌注模型beclin-1表達水平略有升高，高表達MRTF-A后發生CIS/R過程中，beclin-1表達水平顯著升高。這一結果進一步證明了MRTF-A可以通過上調自噬相關基因、激活自噬通路來增強自噬作用。有研究報道，Bcl-2作為抗凋亡蛋白，能與beclin-1的BH3結構域結合，兩者相互作用并調節自噬水平［24-26］。在我們的研究中，當大鼠大腦過表達MRTFA后，缺血區Bcl-2上調的同時beclin-1表達水平持續升高。其原因一方面可能由于MRTF-A調控了其他beclin-1依賴的自噬通路發揮了作用；另一方面可能是由于在神經細胞凋亡程度較重前提下，自噬被MRTF-A激活并有效的抑制了神經凋亡，但其詳細調控機制還有待進一步驗證探討。

綜上所述，CIS/R誘導了大鼠皮層神經細胞的凋亡和輕微自噬反應，MRTF-A通過上調LC3-II和beclin-1表達，增強自噬作用，并通過激活Bcl-2、抑制Bax來增強機體的抗凋亡能力。但自噬的發生十分復雜，MRTF-A在誘導自噬過程中處于何種地位仍需進一步闡明。