重組人血清白蛋白-硫氧還蛋白融合蛋白對流感病毒所致急性肺損傷小鼠的保護作用*

付南燕，徐 娟，韓曉群

（宜春學院醫學院 1病原生物學教研室，2生理學教研室，江西宜春336000）

感染流感病毒可導致多種疾病，如急性肺損傷（acute lung injury，ALI），其具有較高的發病率和死亡率［1］。研究表明，氧化應激在流感引起的ALI的發生和發展中起著重要的作用［2-3］。硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）是一種小型氧化還原蛋白（12 kD），廣泛存在于人體中，是多種氧化應激條件下誘導的防御蛋白之一［4］。然而，Trx血漿半衰期在小鼠中僅為1 h左右，在大鼠中僅為2 h［5-6］，為了獲得滿意的治療結果，需要保持一定的Trx治療濃度。為了增加Trx在血液中的保留時間，本實驗利用畢赤酵母表達系統生產了一種由人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）和Trx組成的基因重組融合蛋白HSATrx［7］。研究表明，在正常小鼠中 HSA-Trx融合蛋白的血漿半衰期與HSA相似，是Trx自身血漿半衰期的10 倍，此外，HSA-Trx在肺中的分布高于 Trx［7］。因此，本研究旨在探討HSA-Trx對流感所致ALI小鼠的影響。

材料和方法

1 實驗動物

60只SPF級5周齡健康雄性ICR小鼠，體重（31±1）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物許可證號為SYXK（滬）2016-0002；小鼠于12 h/12 h明暗循環、25℃和濕度（50±5）%的環境中，接受標準攝食和飲水，自適應飼養1周。

2 主要試劑

藍色瓊脂糖凝膠6FF、HiTrap Phenyl HP柱和PD-10脫鹽柱（GE Healthcare）；Diff-Quick試劑（Solarbio）；考馬斯亮藍染色液、4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenylindole，DAPI）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒（BioLegend）；水合氯醛、4%甲醛、Mayer蘇木精溶液和1%伊紅醇溶液（Sigma）；誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）抗體（Santa Cruz）；3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，NO2-Tyr）抗體（Millipore）。

3 方法

3.1 HSA-Trx融合蛋白的產生 利用畢赤酵母表達系統生產了基因重組融合蛋白HSA-Trx［7］。將轉化后的巴斯德畢赤酵母細胞在1.25 L BMGY液體培養基［1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀（pH 6.0），1.34%硫酸銨作為酵母氮源（無氨基酸），0.000 04%生物素，1%甘油］（增長階段）中培養2 d（A600=2），然后在30°C含有蛋白表達誘導劑和甲醇碳源的800 mL BMMY培養基［1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀（pH 6.0），1.34%硫酸銨作為酵母氮源（無氨基酸），0.000 04%生物素，1%甲醇］（蛋白質誘導階段）中培養3 d。每隔12 h加入甲醇，使甲醇濃度保持在1%，以維持蛋白表達誘導效應。融合蛋白在藍色瓊脂糖凝膠6FF柱上用200 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 5.5）進行色譜純化，透析后在相同緩沖液上平衡。采用蛋白純化儀，5 mL Hi-Trap Phenyl HP柱上進行疏水層析，采用以下條件：緩沖液A：50 mmol/L Tris-HCl/1.5 mol/L硫酸銨（pH 7.0）；緩沖液B：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）；梯度：0～100%緩沖液B 100 mL；流速：3 mL/min。融合蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍R250染色。該融合蛋白的純度可達97%以上。

3.2 ALI小鼠模型的建立及實驗分組 本實驗使用的小鼠H1N1流感病毒PR8株（A/Puerto Rico/8/1934）由中國醫學科學院醫學生物研究所提供，-80℃保存。將小鼠隨機分為4組：健康對照（control）組、ALI組、ALI+Trx組和ALI+HSA-Trx組，每組10只。除健康對照組外，其余處理組小鼠在第0天使用水合氯醛（500 mg/kg）麻醉，流感病毒懸液鼻內接種，劑量為1.5×LD50（用LB培養液稀釋流感病毒懸液），建立流感誘導的ALI小鼠模型。Trx或HSA-Trx組在病毒感染后第4天和第6天經小鼠尾靜脈注射Trx或HSATrx（每只小鼠3.5 nmol蛋白，溶于200 μL生理鹽水中），健康對照組和ALI組小鼠注射200 μL生理鹽水。分別于相應時點處死小鼠，其中第0天于感染后2 h處死小鼠取材，進行療效評價。生存率分析另外取小鼠進行ALI組和ALI+HSA-Trx組實驗，從病毒感染第0～14天，每組10只，這些小鼠未測量其它參數。

3.3 肺灌洗樣本分析 乙醚麻醉小鼠，打開胸腔，取血測定過氧化物（見下文）。氣管插管，用1 mL含5×104U/L肝素的無菌PBS灌肺（2次），收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar larage fluid，BALF）。每只小鼠體內提取約1.8 mL BALF，混勻后取0.5 mL用血細胞計數器計算細胞總數。剩余BALF離心（250×g、10 min、4°C），棄上清液，在 0.9%NaCl中重懸細胞，用Diff-Quick試劑染色細胞，測定肺泡中性粒細胞數量。以BSA為標準品，采用考馬斯亮藍溶液法測定BALF中的蛋白濃度。采用ELISA法測定BALF中IFN-γ的含量。

3.4 肺組織的病理學檢查 將肺組織固定于4%甲醛，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，觀察病理學變化，采用免疫熒光法檢測iNOS、8-OhdG和NO2-Tyr。采用HistoVT One進行抗原檢索，用含有50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）和0.1%吐溫 20（T-TB）的溶液對肺切片進行溶解，在25℃用下BlockAce封閉15 min，加入I抗，4℃下過夜。此外，使用前用0.5%BSA在PBS中稀釋（1∶50）I抗，并與DAPI溶液（10 g/L）偶聯。用T-TB沖洗肺切片，25℃下與II抗反應1.5 h。iNOS和NO2-Tyr免疫染色采用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（H+L）（Invitrogen），8-OHdG免疫染色采用Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG（H+L）（Invitrogen），使用前在PBS中用0.5%BSA稀釋（1∶2 000）。反應后，在顯微鏡下觀察切片。利用ImageJ軟件對iNOS、8-OHdG和NO2-Tyr免疫熒光染色的程度和強度進行圖像分析。

3.5 血漿過氧化物水平的測定 于腹主動脈采血3 mL，并立即于 4℃、1 000×g離心 15 min，收集血漿，-80℃保存。使用CR2000RC分析儀測量血漿中過氧化物濃度。測量單位為U.CARR（Carratelli unit；1 U.CARR相當于0.8 mg/L過氧化氫）。

3.6 肺組織病毒載量測定 取流感病毒感染小鼠的左肺，稱重，在1 mL RPMI-1640培養基中進行勻漿處理，100×g、4℃離心10 min，取上層清液，通過Madin-Darby犬腎（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細胞空斑形成實驗測定病毒滴度。將MDCK細胞接種于24孔板上，培養至融合。PBS沖洗，每次稀釋0.1 mL接種至培養細胞，34℃孵育1 h。每孔加入DMEM 0.5 mL（含青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L和兩性霉素B 0.5 mg/L），在5%CO2、37℃加濕培養箱中培養3 d。計算病毒斑，采用Reed和Muench公式計算50%組織培養感染劑量（median tissue culture infectious dose，TCID50）［8］。

3.7 FITC標記HSA-Trx評價其在流感病毒感染小鼠BALF中的分布 HSA-Trx（4 g/L）和FITC（1 g/L）溶于0.15 mol/L K2HPO4（pH 9.5）中，室溫下混合4 h，經PD-10脫鹽柱脫鹽，洗脫液用Vivapore濃縮。病毒感染后第4天和第6天給模型小鼠靜脈注射FITC標記的HSA-Trx（每只3.5 nmol），正常小鼠第0天給藥，2 h后，用乙醚麻醉小鼠，打開胸腔，抽肺內干血液。氣管插管，用1 mL含5×104U/L肝素的無菌PBS灌肺，收集BALF。每只小鼠體內提取約0.8 mL BALF。BALF在250×g、4℃離心10 min，將BALF中的細胞從液體中分離出來，采用分光光度計檢測BALF中FITC標記的HSA-Trx含量。

4 統計學處理

計量數據表示為均數±標準差（mean±SD）。使用GraphPad Prism 7.0進行統計分析。單因素方差分析（one-way ANOVA）和Bonferroni多重比較分析各組間的差異。使用Kaplan-Meier對數秩檢驗分析生存曲線。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 HSA-Trx對流感病毒感染小鼠體重及存活率的影響

氣管內注射1.5×LD50劑量流感病毒可引起小鼠急性肺損傷，BALF中的總細胞數增加、中性粒細胞的浸潤和總蛋白含量升高在病毒感染后的第4～6天發生，見圖1A～C。此外，流感病毒感染后病毒載量在第4天達到高峰后下降，見圖1D。

ALI組小鼠的體重從病毒感染后第6天開始下降，病毒感染后第14天，僅20%小鼠存活，而HSATrx給藥顯著抑制了病毒感染小鼠體重的下降（P＜0.05），在病毒感染后14天，70%的HSA-Trx治療小鼠仍然存活，存活率顯著高于ALI組小鼠（P＜0.05），見圖2。

2 HSA-Trx對流感病毒感染小鼠損傷的相對抑制作用

HSA-Trx處理小鼠后其BALF中總細胞數顯著低于ALI組和Trx組的小鼠，中性粒細胞數顯著低于ALI組小鼠（P＜0.05），見圖3A、B，HSA-Trx顯著降低了ALI小鼠BALF中的蛋白濃度（P＜0.05），而Trx對降低BALF蛋白濃度沒有顯著作用（P＞0.05），見圖3C。

HE染色的肺切片顯示，與ALI組相比，HSA-Trx處理后肺切片的損傷程度有所減輕（P＜0.05），Trx處理組肺切片的組織病理學結果與ALI組相似，見圖3D。

3 HSA-Trx對BALF中IFN-γ水平及肺中iNOS表達的影響

與健康對照組相比，ALI組小鼠的IFN-γ和iNOS表達水平升高（P＜0.05），而HSA-Trx處理后與ALI組之間沒有顯著性差異（P＞0.05），見圖4。

4 HSA-Trx對肺組織氧化應激的影響

與健康小鼠相比，流感病毒感染小鼠肺組織中8-OHdG和NO2-Tyr表達及血漿過氧化物水平均升高（P＜0.01），而HSA-Trx則顯著抑制了這些氧化應激標志物的表達（P＜0.05），見圖5。

5 在流感病毒感染小鼠BALF中FITC標記的HSA-Trx的分布

Figure 1.Evaluation of influenza virus-induced ALI model mice（0，2，4，6 and 8 days after viral infection）.A：total cells in BALF；B：neutrophils in BALF；C：protein concentration in BALF；D：viral titers in lung tissues.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs day 0.圖1 流感病毒誘導的ALI模型小鼠的評估

Figure 2.Effect of HSA-Trx on body weight（A）and survival rate（B）of mice infected with influenza virus.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs ALI group.圖2 HSA-Trx對流感病毒感染小鼠體重和生存率的影響

第6天FITC標記的HSA-Trx在BALF的分布大約是正常小鼠第0天的4倍（P＜0.01），見圖6。

討 論

Trx對氧化應激相關或炎癥相關的肺部疾病具有有效作用［9］，流感病毒感染是造成肺炎的原因，并伴有ALI等并發癥，可能導致死亡［1］。本研究表明HSA-Trx對流感病毒所致的ALI小鼠有一定保護作用。本研究利用甲型流感病毒H1N1誘導ALI，且在流感病毒感染后的病毒載量在第4天達到峰值，然后下降。因此，HSA-Trx在病毒感染后第4和6天用，顯著降低了小鼠死亡率。結果與以前的報道一致［9］，該研究中重組蛋白Trx-1提高了病毒感染小鼠的存活率。BALF中總蛋白的增加可以評估感染引起的ALI的嚴重程度［10］，本研究中HSA-Trx顯著降低了ALI小鼠BALF中流感病毒誘導的總蛋白含量，而Trx則沒有顯示出療效。此外，從病理學上證實了HSA-Trx改善了小鼠H1N1誘導的肺損傷。與本研究結果類似，Trx對博來霉素誘導的肺損傷沒有顯示有效的保護作用［11］。因此，HSA-Trx的保護作用可能是與其在血液中滯留的時間延長有關［5-6］。

Figure 3.Relative inhibition of HSA-Trx in mice infected with influenza virus（8 days after virus infection）.A：total cells in BALF；B：neutrophils in BALF；C：protein concentration in BALF；D：lung histopathology（HE staining，scale bar=100 μm）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs ALI group.圖3 HSA-Trx對流感病毒感染小鼠肺損傷的作用

Figure 4.Effect of HSA-Trx on IFN-γ levels in BALF and expression of iNOS in lung tissue of mice infected with influenza virus（8 days after virus infection）.A：IFN-γ levels in BALF；B：iNOS/DAPI immunofluorescence in lung tissue sections（scale bar=100 μm）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 HSA-Trx對流感病毒感染小鼠BALF中IFN-γ水平和肺組織中iNOS表達的影響

Figure 5.Effect of HSA-Trx on oxidative stress in mice infected with influenza virus.A：8-OHdG/DAPI immunofluorescence in lung tissue sections（scale bar=100 μm）；B：NO2-Tyr/DAPI immunofluorescence in lung tissue sections（scale bar=100 μm）；C：plasma peroxide levels.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs ALI group圖5 HSA-Trx對流感病毒感染小鼠氧化應激的影響

研究表明，流感病毒感染導致BALF中產生了大量IFN-γ，從而導致肺泡巨噬細胞、支氣管和肺泡上皮細胞中iNOS表達上調［12］。但本研究中HSA-Trx并不能降低因病毒感染而產生的IFN-γ和iNOS表達水平。其他研究表明，活化的白細胞，尤其是肺泡巨噬細胞和中性粒細胞釋放的ROS與流感誘導的ALI有關［2］。研究還顯示BALF中的中性粒細胞濃度與肺部疾病嚴重程度呈正相關［13］。本研究中HSA-Trx對病毒感染引起的中性粒細胞的浸潤有顯著的抑制作用。事實上，中性粒細胞在流感病毒感染后到達肺泡，與白細胞（例如肺泡巨噬細胞）結合。此外，iNOS釋放的NO與活化的白細胞生成的·O2-反應可以產生具有強損傷活性的ONOO-，ONOO-可以硝化多種生物靶點，如蛋白質和脂肪酸，產生NO2-Tyr加合物［14］。本研究中HSA-Trx顯著抑制了肺組織中8-OHdG和NO2-Tyr的表達及血漿過氧化物這些氧化應激標志物的表達。此外，研究報道Trx通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶活化、L-選擇素下調和內皮細胞粘附，對中性粒細胞產生抗趨化作用［5］。因此，HSA-Trx對流感誘導ALI的改善作用機制不僅與抗氧化作用有關，可能還涉及到抗趨化作用。

肺泡液體中白蛋白的濃度通常遠低于血液中，然而在肺損傷的情況下，由于表面活性劑表面張力顯著升高而導致血管高通透性，蛋白濃度可增加到血漿水平的75%～95%［15］。因此，BALF中白蛋白濃度在臨床上被用作肺損傷的生物標志物。本研究結果表明HSA-Trx可明顯降低流感病毒感染小鼠的BALF中蛋白的濃度。

Figure 6.Distribution of FITC-labeled HSA-Trx in BALF of influenza virus-infected mice.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs day 0.圖6 FITC標記的HSA-Trx在流感病毒感染小鼠BALF中的分布

綜上所述，HSA-Trx是一種持久的抗氧化劑和抗炎調節劑，其給藥后能抑制流感病毒誘導的ALI，其機制可能是其抗氧化和抗趨化的共同作用，另外HSA-Trx在病變部位的分布有所不同，即在流感感染者肺間質的分布可能高于健康人。因此，HSA-Trx治療流感病毒引起的肺炎可能具有相當大的潛力。