肥大細胞在小鼠佐劑性關節炎疼痛中的作用及其機制研究*

董甜甜，王金齡，李世剛，柳 蔚，閆夢真，余 婕，陳桂婷，周婷婷

（三峽大學醫學院，湖北宜昌443002）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以滑膜增生，關節軟骨與骨的破壞為特征，伴有慢性持續性的關節疼痛，嚴重危害患者的身心健康，影響患者的生活質量［1］。世界范圍內大約1%的人口患有RA［2］，大部分都遭受著疼痛的折磨，臨床使用糖皮質激素［3］、傳統抗風濕藥和解熱鎮痛藥并不能達到理想鎮痛效果，且易出現一系列的藥物耐受現象和副作用［4-5］；為減輕更多RA患者的痛苦，提高整體生活質量，迫切需要了解關節疼痛的發生發展機制，以發現新的治療靶點，尋找新的風濕鎮痛藥。

肥大細胞來源于骨髓造血干細胞［6］，離開骨髓后以肥大細胞前體形式隨血流遷移，最后定居于全身各處結締組織中增殖分化為成熟的肥大細胞介導免疫反應，其一旦活化可脫顆粒釋放出多種炎性介質，包括類胰蛋白酶（tryptase）、組胺（histamine）和肝素（heparin）和神經生長因子（never growth factor，NGF）等。早期研究發現肥大細胞在RA的病理發生發展過程中扮演重要角色，RA患者和實驗性關節炎小鼠滑膜組織中肥大細胞數量和活化的肥大細胞數較正常滑膜組織明顯增加，而肥大細胞缺乏的小鼠關節炎癥明顯減輕［7-8］，證實了肥大細胞在RA的發生發展過程中可能起著關鍵性作用。

肥大細胞在其它疾病所致疼痛過程中也發揮重要作用。例如，鐮狀細胞性貧血導致的疼痛過程中皮膚組織肥大細胞脫顆粒增加，而經肥大細胞穩定劑處理的小鼠和肥大細胞缺乏的KitW-v小鼠痛覺過敏反應減輕［9］；肥大細胞缺乏的Kitw-sh小鼠誘導慢性膀胱炎，其炎癥病理表現和盆腔疼痛較野生型小鼠明顯減輕，對其進行C57BL/6J小鼠骨髓來源的肥大細胞再移植后，盆腔疼痛和病理表現再次出現，經H1和H2受體拮抗劑治療后盆腔疼痛緩解［10］。這說明肥大細胞及其脫顆粒介質在慢性炎癥性疼痛病理中可能發揮作用。

雖然肥大細胞參與多種疾病疼痛病理過程，卻未見肥大細胞與RA疼痛的相關報道，本研究基于肥大細胞在RA炎癥病理過程中發揮的作用，推測肥大細胞可能也介導了關節炎疼痛的發生。本項工作采用完全弗氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）構建小鼠佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）疼痛模型［11］，探討肥大細胞在RA關節疼痛中的作用及其可能機制。

材料和方法

1 材料

SPF級雌性C57BL/6小鼠18只，體重20～30 g，周齡為6～8周，購自湖北省實驗動物研究中心，許可證號為SCXK（鄂）2015-0018。雌性KitW-4Bao小鼠（Kit基因突變小鼠，背景品系為C57BL/6J小鼠，體內肥大細胞缺乏）6只，體重20～30 g，由杭州師范大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（浙）2011-0048。PL-200熱刺痛儀（成都泰盟科技有限公司）；von Frey電子測痛儀（ALMEMO 2390-5，AHLBORN）；游標卡尺（東莞市景有模具五金有限公司）；多功能顯微鏡及圖像分析系統（Leica）；酶標儀（Tecan）。CFA（Chondrex）；甲苯胺藍（toluidine blue，TB；武漢谷歌生物科技有限公司）；色甘酸鈉（cromolyn sodium，CS；一種肥大細胞穩定劑；上海生工生物工程有限公司）；ELISA試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥 將正常雌性C57BL/6小鼠隨機分為3組：正常對照組（control組）、AA模型組（model組）和AA模型+CS組（CS組），每組6只。6只雌性KitW-4Bao小鼠（Kit基因突變小鼠，背景品系為C57BL/6J小鼠，表現為肥大細胞缺乏）作為AA模型+肥大細胞缺失組（W-4Bao組）。除control組注射等體積生理鹽水外，其它各組小鼠右后足底皮下注射CFA 30 μL構建AA模型［11-12］，1 d后觀察到注射側足掌明顯紅腫說明造模成功。CS組小鼠在CFA注射1 d后開始腹腔注射CS（20 mg/kg）［9］，其余各組小鼠均給予等體積生理鹽水，每日1次，持續給藥14 d。

2.2 小鼠足趾腫脹度測定 分別于小鼠致炎第0、1、3、7、10和14天使用游標卡尺測量小鼠雙后肢的足掌厚度［13］。

2.3 機械刺激縮爪反應閾值（paw withdrawal threshold，PWT）測量 分別在致炎第0、1、3、7、10和14天使用von Frey電子測痛儀檢測機械疼痛閾值［12］。將小鼠置于透明的玻璃器皿下，底為1 cm×1 cm孔徑的鐵絲網，待小鼠適應30 min后開始檢測。用一根連接在von Frey電子測痛儀探頭上的金屬絲（直徑約為0.5 mm）垂直向上刺激小鼠足底，小鼠抬足的瞬間記錄下疼痛閾值（g），每只足重復測量3次取平均值，每次測量間隔15 s。

2.4 熱刺激縮爪反應潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）測量 在小鼠致炎第0、1、3、7、10和14天使用熱刺痛儀檢測小鼠縮爪反應時間［12］。測定前，將小鼠置于熱刺痛儀的玻璃板上，并用透明玻璃杯限制其活動范圍，適應環境30 min，待小鼠處于安靜狀態時，開始進行檢測。移動輻射熱光源，對準小鼠后足貼近玻璃板的部位，從給予輻射熱刺激開始計時，直至大鼠產生縮爪反應時記錄下縮爪反應潛伏時間（s）。每只小鼠測試間隔10 min以上，測試3次取平均值。

2.5 關節組織病理評價 14 d后處死小鼠，獲取右后肢踝關節，4%多聚甲醛固定后，組織浸于10%EDTA進行脫鈣，至骨組織變軟后進行常規脫水，石蠟包埋切片。切片進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學顯微鏡下觀察踝關節組織的病理改變，進行關節炎評分［12］：根據組織病變程度分為4級，逐級記為0～3分，累計總分為關節組織病理分數，最嚴重的病理評分可達9～10分，見表1。

表1 關節組織病理評分系統Table 1.Joint histopathology scoring system

2.6 TB染色 小鼠踝關節組織石蠟切片經常規脫蠟水化后用0.5%TB染液染色5 min，沖洗后冰醋酸分化數秒，經脫水，二甲苯透明后封片。切片在光學顯微鏡下觀察到的含紫紅色顆粒的細胞為肥大細胞，其中細胞膜完整、細胞核染色清楚的為穩定狀態肥大細胞；細胞膜破裂、周圍組織中存在藍染顆粒的為脫顆粒肥大細胞［14］。選取不同視野進行肥大細胞計數，每張切片選擇3個視野進行計數，求平均值，并計算肥大細胞脫顆粒率。脫顆粒率（%）=脫顆粒肥大細胞數量/肥大細胞總數×100%。

2.7 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測小鼠踝關節組織中炎癥因子和神經肽水平 取小鼠踝關節加入PBS進行組織勻漿，吸取上清，參考ELISA試劑盒說明書檢測上清中histamine、tryptase、P物質（substance P，SP）和降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）的濃度［15］。

3 統計學處理

實驗數據應用GraphPad Prism 5軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行統計，組間均數多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠致炎前后足趾腫脹度

小鼠注射CFA 1 d后，致炎側后肢肉眼可見明顯紅腫，對側及注射生理鹽水的小鼠未見明顯改變；經測量，與正常control組相比，model組小鼠的右側足掌厚度在致炎1 d后顯著增加（P＜0.05），腫脹持續至14 d，小鼠伴有跛行和舔足反應，見圖1。

2 熱刺激（PWL）和機械刺激（PWT）痛敏反應

小鼠致炎1 d后，注射CFA的一側后肢PWL和PWT較control組顯著降低（P＜0.05），痛覺過敏持續至14天，對側后肢以及正常control組的后肢未見明顯疼痛反應，與注射CFA的model組野生型小鼠相比，KitW-4Bao小鼠痛閾值保持在較高水平（P＜0.05）；經CS干預治療后的第7天開始，小鼠PWL和PWT逐漸升高，與model組小鼠相比有顯著差異（P＜0.05），見圖1。

3 關節組織病理評分

組織切片經HE染色顯示，control組關節面光滑，未見炎癥細胞浸潤和滑膜增生；model組關節腔狹窄，伴有大量炎癥細胞浸潤、關節滑膜增生等典型關節炎病理表現；CS組較model組炎癥表現明顯減輕，炎癥細胞，滑膜增生減少；W-4Bao組炎癥癥狀不明顯。組織病理分數統計分析結果顯示model組小鼠評分顯著高于control組（P＜0.05），W-4Bao組和CS組的評分顯著低于model組（P＜0.05）。見圖2。

Figure 1.The swelling of the paw and the pain threshold before and after the inflammation in mice.A：visual observation of right hind paw swelling in mice；B：ankle thickness change in control group and model group.C：the changes of paw withdrawal latency in control group，model group，W-4Bao group and CS group；D：the changes of paw withdrawal threshold in control group，model group，W-4Bao group and CS group.Mean±SD，n=6.*P＜0.05 vs control group，#P＜0.05 vs model group.圖1 小鼠致炎前后足掌腫脹情況和痛域變化

4 肥大細胞脫顆粒情況

Figure 2.HE staining and pathological score of mouse joint tissues in control group（A），model group（B），W-4Bao group（C）and CS group（D）.The scale bar=100 μm.The arrows indicate joint cavity narrowing，synovial hyperplasia，and inflammatory cell infiltration.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖2 關節組織病理評分

踝關節組織切片TB染色結果顯示，model組較control組總的肥大細胞數量和脫顆粒的肥大細胞均顯著增加（P＜0.05），W-4Bao組幾乎未見肥大細胞，CS組較model組的肥大細胞數量及脫顆粒率均顯著降低（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.The number of mast cells and the degranulation rate of mast cells in mouse joint tissues in control group（A），model group（B），W-4Bao group（C）and CS group（D）were evaluated by toluidine blue staining（scale bar=20 μm）.The red arrows indicate stable mast cells，while the yellow arrows indicate degranulated mast cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖3 踝關節組織肥大細胞活化情況

5 踝關節組織炎癥因子和神經肽釋放情況

ELISA法檢測結果顯示，model組中histamine、tryptase、SP和CGRP的表達量均比control組顯著升高（P＜0.05），其在CS組和W-4Bao組中的表達量較model組顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組踝關節組織炎癥因子和神經肽釋放水平比較Table 2.Comparison of release levels of inflammatory factors and neuropeptides in ankle joint tissues of each group（μg/L.Mean±SD，n=6）

討 論

目前國內外針對肥大細胞在RA中的作用研究多集中在炎癥方面，對RA疼痛研究較少。弗氏佐劑關節炎可產生動物自身免疫反應性炎癥，模擬RA引起的疼痛，屬于慢性疼痛模型，適用于RA疼痛發病機制及鎮痛藥物作用的研究［13］。本實驗通過小鼠右后肢足底皮下注射CFA，構建AA疼痛模型，1 d后小鼠注射側明顯紅腫，活動受限并伴隨一些疼痛反射行為，提示造模成功。

肥大細胞在組織中通常鄰近血管和神經分布，肥大細胞脫顆粒可調節神經興奮性，反過來神經元釋放的神經遞質也可活化肥大細胞。在交感神經元與大鼠嗜堿性粒細胞性白血病RBL-2H3細胞以及大鼠腹腔肥大細胞共培養實驗中，觀察到神經元和肥大細胞的膜與膜之間形成類似突觸樣聯系，用緩激肽刺激神經細胞可觀察到RBL-2H3細胞活化并出現細胞膜的波動現象［16］，這一現象直觀表明了肥大細胞與神經之間存在著某種內部聯系，為肥大細胞在疼痛病理過程中發揮作用提供了依據。

機械和熱刺激痛閾的測定被廣泛用于評估實驗動物疼痛等級。為證實肥大細胞在CFA誘導的AA疼痛中的作用，本研究采用肥大細胞缺乏的KitW-4Bao小鼠［17］誘導AA模型，同時對AA模型小鼠使用肥大細胞穩定劑CS進行干預治療。實驗結果顯示：model組小鼠的PWL和PWT較control組顯著降低，而CS組和W-4Bao組小鼠痛閾均高于Model組，從疼痛行為學的角度證實肥大細胞能夠促進關節炎疼痛的發生。

肥大細胞在組織免疫炎癥狀態下，通過脫顆粒釋放出多種炎性介質，如histamine和tryptase等，通過炎性介質與組織細胞的相互作用，放大炎癥信號，導致持續性的慢性炎癥發生和發展［18-19］。本實驗通過TB染色觀察肥大細胞在踝關節組織中的分布及活化情況，結果觀察到control組踝關節組織中肥大細胞數量以及活化數量較少，而model組中肥大細胞數量和活化脫顆粒的肥大細胞數量顯著增加，肥大細胞缺乏的W-4Bao組以及使用肥大細胞穩定劑處理后的CS組的肥大細胞活化程度均減輕。ELISA檢測踝關節組織勻漿中炎癥介質histamine和tryptase的釋放情況，結果顯示model組中這兩種炎癥介質含量較control組明顯增加，而CS組和W-4Bao組較model組含量降低，表明CFA誘導的關節炎能夠促進肥大細胞活化，組織中肥大細胞數量與關節炎癥嚴重程度具有一定關系，抑制肥大細胞活化能有效緩解關節炎癥和疼痛。

SP和CGRP是在疼痛過程中起重要作用的神經遞質，廣泛分布于中樞神經系統和外周神經系統，由感覺神經元分泌，在傷害性機械、熱和化學等刺激下，神經末梢被激活可釋放大量SP和CGRP，在慢性炎癥疼痛中發揮重要作用。先前的研究證實關節中存在大量的肽能神經元能夠分泌SP和CGRP，在膠原誘導的關節炎中觀察到背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）神經元和脊髓背角中CGRP表達上調，痛覺敏感性增強［20］；在CFA誘導的大鼠慢性膝關節炎模型中出現同側小直徑DRG神經元CGRP陽性表達率明顯增加［21］。有研究［22］表明雷公藤甲素能夠抑制AA大鼠脊髓背角和DRG中SP的表達，并緩解了50%機械縮足反應閾值。對于慢性關節炎癥（RA和骨關節炎）的研究顯示關節炎病人血清SP濃度與慢性疼痛強度呈正相關關系［23］，在炎癥狀態下，關節周圍組織中的神經纖維及相應受體被激活，可釋放神經肽引起痛敏，SP和CGRP的釋放可能是導致關節炎疼痛的重要原因。

本實驗檢測了小鼠踝關節組織中SP和CGRP的釋放情況，結果顯示與control組相比，CFA誘導的model組小鼠痛敏反應明顯增強，伴隨SP和CGRP濃度顯著增加，此結果與相關文獻報道一致，SP和CGRP濃度與關節疼痛有聯系。CS處理的CS組和肥大細胞缺乏的W-4Bao組較model組神經肽的釋放顯著減少，提示肥大細胞能夠調控小鼠踝關節組織中神經肽的分泌，進而影響關節炎疼痛的發生，這一過程可能和肥大細胞與關節神經末梢之間的相互作用有關。

神經免疫系統相互作用機制在多種疾病中已有報道，本實驗展示了CFA誘導的小鼠慢性AA使關節痛敏反應增強，促進了肥大細胞的活化和神經肽的釋放；而肥大細胞缺乏的小鼠和使用肥大細胞穩定劑處理過的小鼠能夠有效減輕關節炎癥，緩解關節疼痛，減少了神經肽SP和CGRP的釋放，表明肥大細胞是促進AA疼痛發生的重要中介，首次闡述了肥大細胞在關節炎疼痛中發揮重要作用，為治療RA疼痛提供了新的治療思路。然而肥大細胞與關節組織中傷害性感受神經元之間具體的相互作用尚不清楚，它們之間是否存在著密切的聯系有待進一步探討，以更加明確肥大細胞在關節疼痛中的作用機制，為尋找更明確的關節疼痛治療靶點提供更堅實的依據。