基于Hedgehog通路探討補腎活血方對實驗性膝骨性關節炎兔退變軟骨的保護作用*

賀自克，王上增，沈錦濤

（河南省中醫院關節科，河南鄭州450000）

膝骨性關節炎屬于退行性骨關節疾病，在中老年人中患病率較高，嚴重影響患者生活，給家庭、社會帶來一定的負擔［1］。目前國內外學者主要從細胞因子、基質金屬蛋白酶、免疫反應等方面探究膝骨關節炎發病機制，然而尚未有統一定論。近年來發現Hedgehog通路在膝骨關節炎的發生中扮演重要角色，研究顯示Hedgehog通路激活后可誘導大鼠關節軟骨損傷，而抑制Hedgehog通路活化則對軟骨具有保護作用，推測Hedgehog通路在軟骨退變中發揮重要作用［2］。鎮痛藥及非甾體藥物是目前治療膝骨關節炎常用的方法，但僅能緩解關節炎的發展，不能達到治愈的目的，因此減輕膝骨關節炎的軟骨退變，誘導損傷軟骨修復，是治療膝骨關節炎的關鍵［3］。補腎活血方（Bushen-Huoxue prescription，BSHX）主要由熟地黃、丹參等中藥組成，具有活血、鎮痛、消炎、行氣散寒等功效，在骨關節炎治療中應用較多［4］，然而具體作用機制目前尚不明確。本研究通過復制膝骨性關節炎動物模型，并給予BSHX干預，旨在探究BSHX對膝骨關節炎退變軟骨的保護作用及可能的作用機制。

材料和方法

1 動物及藥物制備

30只雄性新西蘭兔，SPF級，10周齡，體質量（2.0±0.2）kg，購于河南省康華藥業股份有限公司，許可證號為SYXK（豫）2017-0015，動物飼養室溫為20～22℃，空氣濕度為40%～60%，飼養1周后造模。

補腎活血方包含：桑寄生、積血、熟地黃、龜板、黃芪、白芍各30 g，阿膠、懷牛膝、補骨脂各20 g，地龍15 g，丹參、仙鶴草、當歸各10 g。加水浸泡上述藥材，溫火煎煮1 h，過濾后加水再次煎煮30 min，收集兩次藥液，濃縮后依據人與兔體表面積換算法，給藥劑量為1.86 g/kg（生藥量）［5］。

2 主要試劑及儀器

Hedgehog通路激活劑 SAG（912545-86-9）購于MCE；TRIzol試劑（DP424）購于北京天根生化科技有限公司；BCA檢測試劑盒（SP900）、RIPA裂解液（PP1901）、免疫組化檢測試劑盒（PV6000）、HE染色試劑盒（C0105）及 TNF-α（PT516）和IL-Iβ（PI130）檢測試劑盒均購于碧云天生物技術研究所；番紅O染色試劑盒（G1371）購于北京索萊寶有限公司；兔抗Shh抗體（SAB2108581）、Ptch1抗體（SAB2501613）、Smo抗體（SAB1412475）、Gli1抗體（HPA068903）和β-actin抗體（A5316）均購于Sigma-Aldrich；兔抗基質金屬蛋白酶13（matrix metalloprotein-13，MMP-13）抗體（ab237604）和II型膠原（collagen type II，Col-II）抗體（ab198200）購于Abcam。2500凝膠成像儀和EPS300垂直電泳儀購自于Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 動物模型制備 從30只新西蘭兔中隨機抽取6只作為對照（control）組，其余24只參照Hulth法［6］制備膝骨關節炎模型，模型組兔仰臥手術臺，麻醉后去除右肢后方膝關節內側絨毛，于髕骨內制做縱向1 cm切口，逐層剝離后暴露內側副韌帶并剪斷，切開關節囊將內側半月板完全切除，同時將前后交叉韌帶剪斷，用生理鹽水沖洗關節，消毒后縫合切口，采用無菌敷料加壓固定。造模后連續3天注射青霉素（8×104U/d），隔天換藥，2周后拆線，兔出現典型膝骨性關節炎表現（關節腫脹，關節活動度降低，皮溫升高），則視為模型成功。control組兔僅進行麻醉，切開膝關節皮膚，不做其它處理。

3.2 動物分組與給藥 造模8周后，將24只模型兔分為模型組（model組）、BSHX組、SAG組和BSHX+SAG組，每組6只。BSHX組：灌胃BSHX，劑量為1.86 g/kg；SAG組：灌胃SAG溶液，劑量為20 mg/kg［7］。BSHX+SAG組：灌胃 1.86 g/kgBSHX與 20 mg/kg SAG。Control組和model組灌胃等量生理鹽水。各組均連續給藥8周。

3.3 兔膝關節寬度則定 末次給藥結束后，由兩名工作人員用標尺測量各組兔膝關節寬度，記錄數據，重復測量3次，求取平均值。

3.4 膝關節大體情況觀察 各組兔處死后獲得右膝關節，觀察軟骨表面顏色、光滑度、光澤、潰瘍等變化，依據Pelletier評分［8］對軟骨退變情況進行評定；參照軟骨分級標準［9］，將軟骨表面狀態分為4個等級，等級越高代表軟骨退變越嚴重。

3.5 軟骨組織病理形態學觀察 截取脛骨近端1/4處到股骨遠端1/4處膝關節，一部分膝關節軟骨組織置于-80℃保存，另一部分膝關節軟骨組織10%多聚甲醛固定。取出固定軟骨組織，經脫鈣、水合、透明、石蠟包埋后制備膝關節軟骨組織石蠟切片，厚度為5 μm，參照試劑盒進行HE染色和番紅O染色。依據Mankin評分［10］對兔膝關節軟骨組織細胞、潮線、基質染色等情況進行評定，評分為0～13分，評分越高，代表軟骨組織退變越嚴重。

3.6 酶聯免疫法檢測軟骨組織勻漿中TNF-α和IL-1β水平 從-80℃冰箱取出軟骨組織，稱取1 mg，添加9 mg/L生理鹽水，在勻漿器內制備組織勻漿液，5 000×g離心10 min，收集上清，采用酶聯免疫檢測試劑盒對TNF-α和IL-1β水平進行測定。

3.7 免疫組化法檢測軟骨組織中MMP-13和Col-II蛋白表達 將石蠟切片烘烤后，經脫蠟、水合后在熱檸檬酸鹽緩沖液中修復2 min，添加3%過氧化氫室溫下反應15 min，添加山羊血清封閉抗原后，室溫下加入I抗（1∶500稀釋），4℃冰箱中孵育16～18 h，添加II抗（1∶5 000稀釋）室溫下孵育1 h，DAB顯色后，水洗添加蘇木素染色、溫水返藍，切片經脫水、透明、中性樹脂封片后在顯微鏡下觀察蛋白染色情況，MMP-13和Col-II主要定位在細胞質內，細胞質內出現棕黃色或棕褐色視為陽性染色細胞。采用ImageJ軟件定量評估陽性表達率，陽性表達率（%）=細胞陽性數/細胞總數×100%。

3.8 Western blot法檢測軟骨組織中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表達 采用RIPA裂解液提取膝關節軟骨組織全蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，經SDSPAGE后，將目的蛋白轉移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉膜后，I抗（抗Shh、Ptch1、Smo和Gli1抗體，均1∶500稀釋）4℃孵育膜過夜，用II抗室溫孵育膜1 h，經ECL發光液顯色后，在凝膠成像儀中采集保存圖像，以β-actin為內參照，利用ImageJ軟件分析蛋白相對表達量。

4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 22.0軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（mean±SD）描述，多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩對比采用SNK-q檢驗。當P＜0.05時認為差異有統計學意義。

結 果

1 兔膝關節一般情況

肉眼觀察可見，control組兔膝關節大體正常，未出現畸形、腫脹等；model組兔膝關節出現腫脹，皮膚充血，行走出現輕微跛行；經BSHX治療后，膝關節腫脹和皮膚充血均得到一定緩解，無明顯跛行；SAG干預后兔膝關節腫脹、充血更為嚴重，出現較明顯跛行；BSHX+SAG組兔膝關節得到緩解，但效果不顯著。與control組相比，model組膝關節寬度顯著增大（P＜0.05）；與model組相比，BSHX組膝關節寬度顯著減小，SAG組膝關節寬度顯著增大（P＜0.05）；BSHX+SAG組膝關節寬度顯著小于SAG組（P＜0.05），見表1。

表1 各組兔膝關節寬度對比Table 1.Comparison of knee joint swelling in rabbits of each group（Mean±SD.n=6）

2 膝關節軟骨大體情況

與control組相比，model組軟骨退變評分和軟骨分級顯著升高（P＜0.05）；與model組相比，BSHX組軟骨退變評分和軟骨分級顯著降低，SAG組軟骨退變評分和軟骨分級顯著升高（P＜0.05）；BSHX+SAG組軟骨退變評分和軟骨分級顯著低于SAG組（P＜0.05），見表2。

表2 各組兔軟骨退變情況比較Table 2.Comparison of cartilage degeneration in rabbits in each group（Mean±SD.n=6）

3 膝關節病理形態學觀察

HE和番紅O染色均顯示，control組軟骨組織結構清晰，骨膜完整光滑，細胞排列整齊，潮線完整清晰，染色均勻；model組軟骨組織結構不清晰，細胞排列紊亂，體積增大，潮線不清晰，細胞質基質染色變淺；經BSHX干預后軟骨組織及細胞形態均得到一定改善，細胞質基質染色變深；SAG組軟骨表層損傷較嚴重，細胞成簇增殖，形態不規則，潮線不完整或消失，細胞質基質染色不均；BSHX+SAG組軟骨組織及細胞形態損傷有所減輕，但變化不顯著，見圖1、2。

Figure 1.The pathological changes of cartilage tissues observed by HE staining（scale bar=50 μm）.The articular cartilage is indicated by the box.A：control group；B：model group；C：BSHX group；D：SAG group；E：BSHX+SAG group.圖1 HE染色觀察軟骨組織病理學變化

與control組相比，model組Mankin評分顯著升高（P＜0.05）；與model組相比，BSHX組Mankin評分顯著降低，SAG組Mankin評分顯著升高（P＜0.05）；BSHX+SAG組Mankin評分顯著低于SAG組（P＜0.05），見表3。

Figure 2.The pathological changes of cartilage tissues observed by safranine O staining（scale bar=50 μm）.A：control group；B：model group；C：BSHX group；D：SAG group；E：BSHX+SAG group.圖2 番紅O染色觀察軟骨組織病理形態學

表3 各組軟骨組織Mankin評分比較Table 3.Comparison of Mankin score of cartilage tissue in each group（Mean±SD.n=6）

4 BSHX對軟骨組織TNF-α和IL-1β的影響

與control組相比，model組軟骨組織中TNF-α和IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05）；與 model組相比，BSHX組軟骨組織中TNF-α和IL-1β水平顯著降低，SAG組軟骨組織中TNF-α和IL-1β水平顯著升高（P＜0.05）；BSHX+SAG組軟骨組織中TNF-α和IL-1β水平顯著低于SAG組（P＜0.05），見表4。

表4 各組軟骨組織中TNF-α和IL-1β水平比較Table 4.Comparison of TNF-α and IL-1β levels in cartilage tissue of each group（ng/L.Mean±SD.n=6）

5 BSHX對軟骨組織MMP-13和Col-II表達的影響

與control組相比，model組軟骨組織中MMP-13陽性表達率顯著升高，而Col-II陽性表達率顯著降低（P＜0.05）；與 model組相比，BSHX 組軟骨組織中MMP-13陽性表達率顯著降低，Col-II陽性表達率顯著升高，SAG組軟骨組織中MMP-13陽性表達率顯著升高，Col-II陽性表達率顯著降低（P＜0.05）；BSHX+SAG組軟骨組織中MMP-13陽性表達率顯著低于SAG組，Col-II陽性表達率顯著高于SAG組（P＜0.05），見圖3及表5。

Figure 3.Immunohistochemical staining for MMP-13 and Col-II expression in cartilage tissues（SP method，scale bar=100 μm）.A：control group；B：model group；C：BSHX group；D：SAG group；E：BSHX+SAG group.圖3 免疫組化檢測軟骨組織中MMP-13和Col-II的表達

表5 各組軟骨組織MMP-13和Col-II陽性表達率的比較Table 5.Comparison of positive expression rates of MMP-13 and Col-II in cartilage tissue of each group（%.Mean±SD.n=6）

6 BSHX對軟骨組織中Hedgehog通路表達的影響

與control組相比，model組軟骨組織中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與model組相比，BSHX組軟骨組織中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表達顯著降低，SAG組軟骨組織中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；BSHX+SAG組軟骨組織中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表達顯著低于SAG組（P＜0.05），見圖4及表6。

Figure 4.The protein expression of Shh，Ptch1，Smo and Gli1 in cartilage tissues detected by Western blot.A：control group；B：model group；C：BSHX group；D：SAG group；E：BSHX+SAG group.圖4 Western blot檢測軟骨組織中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表達

表6 各組軟骨組織中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表達比較Table 6 Comparison of protein expression of Shh，Ptch1，Smo and Gli1 in cartilage tissue of each group（Mean±SD.n=6）

討 論

膝骨關節炎是以軟骨變性、關節周圍骨質增生為特征的慢性關節炎癥性疾病［11］。本研究通過采用Hulth手術造模法復制兔膝骨關節炎模型，手術切除膝關節前交叉韌帶、關節內側副韌帶等造成關節力學失穩，誘發膝骨關節炎，與臨床發病機制相似［12］。本研究結果表明，與control組相比，model組兔出現膝關節腫脹、寬度增加、活動減小等膝骨關節炎典型特征。關節軟骨退變為膝骨關節炎的主要病理特征，關節負重前側軟骨發生糜爛后，軟骨細胞密度增高，隨后軟骨結構紊亂，潮線消失或上移。本研究顯示，model組軟骨退變評分和軟骨分級顯著升高，HE染色觀察到軟骨表面不平滑、粗糙，出現一定潰瘍，結構不清晰，細胞排列紊亂，體積增大，潮線不清晰，細胞質基質染色變淺，Mankin評分顯著升高，與以往膝關節炎動物病理檢測結果相似［13］，提示兔膝骨關節炎模型制備成功。

膝骨關節炎在中醫中屬于骨痹、痹癥、瘀證等范疇，中醫認為膝部受風寒后滯于患處，長久凝集使筋脈損傷、痙攣，造成關節功能障礙，此外體虛、肝腎功能較弱會影響機體氣血運行，造成氣凝滯于關節，因此治療該病的關鍵在于補腎活血［14］。補腎活血方主要由桑寄生、積血、熟地黃、龜板等組成，該方中熟地黃具有滋陰補血功效，丹參具有活血消腫的功效，整方具有補腎活血之功效。研究表明，BSHX能夠提高骨性關節炎治療效果，顯著減輕患者關節疼痛程度［15］。本研究表明，與model組相比，BSHX組兔膝關節退變評分、軟骨分級降低，HE染色顯示關節軟骨組織、細胞形態均得到一定緩解，細胞質基質染色變均勻，提示BSHX可減輕兔膝關節炎軟骨損傷，延緩關節軟骨退變，然而具體機制尚不清楚。

關節軟骨細胞微環境由多型膠原、關節液及細胞外基質組成，其中Col-II是含量最高的膠原之一，正常生理狀態下軟骨細胞主要分泌Col-II，I型膠原（collagen type I，Col-I）分泌極少，而軟骨受損后，細胞微環境發生變化，會導致膠原蛋白變化，造成Col-II含量降低，Col-I含量升高，進而改變軟骨結構［16］。本研究顯示model組Col-II蛋白陽性表達率顯著降低，給予BSHX后Col-II蛋白陽性率明顯升高，提示膝骨關節炎兔軟骨組織結構發生異常，BSHX可以通過上調Col-II含量而促進軟骨修復。炎癥因子與膝骨關節炎的發生、發展密切相關。有研究證實，TNF-α和IL-Iβ活化后放大炎癥反應，降低軟骨組織中Col-II含量，誘導基質中MMP-13的釋放，降解完整的Col-II［17］。本研究顯示，model組 TNF-α和IL-Iβ 水平及MMP-13陽性表達率升高，給予BSHX后TNF-α和IL-Iβ水平及MMP-13陽性表達率降低，提示BSHX可能通過減弱軟骨組織炎癥反應，維持細胞外基質膠原平衡，發揮對軟骨組織的保護作用。

Hedgehog通路與軟骨組織的發育、增殖、分化等密切相關。該通路主要由4個部分組成，包括：Hh蛋白家族（Shh、Dhh和Ihh），跨膜受體Ptch1和Smo，轉錄因子Gli1。正常情況下Ptch1與Smo相互作用后抑制Smo活性，當Hh蛋白與Ptch1結合后能夠解除Ptch1對Smo的抑制，引發通路活化，激活轉錄因子Gli1進入細胞核調節下游靶基因轉錄［18］。既往研究表明，Hedgehog通路異常激活與骨性關節炎的發生及軟骨損傷程度相關［19］。Thompson 等［20］的研究表明，Shh蛋白在正常人的軟骨中幾乎不表達，在軟骨損傷初期，該蛋白水平明顯升高。動物研究報道，TGF-β II型受體顯性負突變體小鼠軟骨組織中Shh蛋白表達升高，同時小鼠出現軟骨細胞肥大等與人骨關節炎損傷相似的表現［21］。Zhou等［22］通過動物研究表明，Hh通路蛋白表達越高，膝骨關節損傷越嚴重，而采用Hh信號通路抑制劑處理后大鼠軟骨損傷減輕。本研究顯示，與control組相比，model組Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表達顯著升高，給予BSHX干預后Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白降低，推測BSHX可能通過抑制Hedgehog通路的活化，進而發揮對膝骨關節炎軟骨損傷的保護作用。為證實這一推測，本研究采用Hedgehog通路激活劑SAG處理兔模型組，其結果表明，SAG組膝關節軟骨損傷更嚴重，關節軟骨退變評分和Mankin病理評分進一步升高，TNF-α、IL-1β和MMP-13表達升高，Hedgehog通路蛋白表達升高；而給予SAG聯合BSHX處理后，兔膝關節軟骨損傷有所減輕，關節軟骨退變得到緩解，TNF-α、IL-1β和MMP-13表達降低，提示BSHX可通過抑制Hedgehog通路進而緩解膝骨關節炎兔軟骨退變，抑制軟骨細胞外基質膠原失衡，減弱炎癥反應，發揮對軟骨組織的保護作用。

綜上所述，補腎活血方可抑制Hedgehog通路活化，延緩膝骨關節軟骨退變，減弱關節炎癥反應，維持軟骨細胞外基質膠原平衡。這可能為膝骨關節炎治療提供新的思路。然而膝骨關節炎發生機制較復雜，補腎活血方具體通過Hedgehog通路下游哪些靶基因發揮作用，尚待后續深入探究。