鋅離子螯合劑對抗NMDA受體腦炎 致海馬神經元損傷的保護作用

李振宏

摘要：目的? 研究鋅離子螯合劑（TPEN）干預抗抗N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體腦炎誘導的神經元損傷的作用及機制，為治療抗NMDA受體腦炎提供新的研究靶點。方法? 選取成年Wistar大鼠40只，隨機分為TPEN組、ZnSO4組、對照組和正常組4組，各10只。建立抗NMDA受體腦炎誘導的體外神經元細胞損傷模型，應用臺盼藍染色、細胞免疫組織化學、TUNEL神經元細胞凋亡檢測和熒光鋅離子探針技術檢測鋅離子螯合劑干預抗NMDA受體腦炎導致神經元損傷的作用機制。結果? 谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時，細胞凋亡率隨著谷氨酸濃度升高而上升（P<0.05）;在谷氨酸濃度為200﹑300﹑400 μmol/L時，神經元凋亡率隨著濃度上升而下降（P<0.05）。凋亡后24、48、72 h，TPEN組、ZnSO4組及對照組神經元凋亡率高于正常組，神經元存活率低于正常組，且TPEN組神經元凋亡率低于ZnSO4組及對照組，神經元存活率高于ZnSO4組及對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;TPEN組、ZnSO4組及對照組Caspase-3陽性率高于正常組，且TPEN組Caspase-3陽性率低于ZnSO4組及對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;TPEN組鋅離子陽性細胞數低于對照組及ZnSO4組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論? TPEN干預神經元損傷的機制可能是通過抑制鋅離子流向細胞內，促進Caspase-3表達減少，從而減少細胞凋亡的發生。

關鍵詞：鋅離子螯合劑;抗NMDA受體腦炎;神經元

中圖分類號：R741? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.08.029

文章編號：1006-1959（2020）08-0092-04

Abstract：Objective? To study the effect and mechanism of zinc ion chelating agent （TPEN） on anti-N-methyl-D-aspartic acid （NMDA） receptor encephalitis-induced neuronal damage， for the treatment of anti-NMDA receptor encephalitis Provide new research targets.Methods? 40 adult Wistar rats were selected and randomly divided into 4 groups of TPEN group， ZnSO4 group， control group and normal group， 10 rats each. Establish anti-NMDA receptor encephalitis-induced neuronal cell damage model in vitro， using trypan blue staining， cellular immunohistochemistry， TUNEL neuronal cell apoptosis detection and fluorescent zinc ion probe technology to detect zinc ion chelating agents to interfere with anti-NMDA The mechanism of body encephalitis causing neuron damage.Results? When the glutamate concentration is 100， 200 μmol/L， the apoptosis rate increases with the glutamate concentration （P<0.05）; when the glutamate concentration is 200， 300， 400 μmol / L， the nerve rate of meta-apoptosis decreased with increasing concentration （P<0.05）. At 24， 48， and 72 h after apoptosis， the neuronal apoptosis rate in the TPEN group， ZnSO4 group， and control group was higher than that in the normal group， the neuron survival rate was lower than that in the normal group， and the neuron apoptosis rate in the TPEN group was lower than that in the ZnSO4 group and in the control group， the neuron survival rate was higher than that in the ZnSO4 group and the control group， the difference was statistically significant（P<0.05）; The positive rate of Caspase-3 in TPEN group， ZnSO4 group and control group was higher than that in normal group， and the positive rate of Caspase-3 in TPEN group was lower than that in ZnSO4 group and control group， the difference was statistically significant（P<0.05）; zinc ion positive in TPEN group The number of cells was lower than that in the control group and the ZnSO4 group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion? The mechanism by which TPEN interferes with neuronal damage may be by inhibiting the flow of zinc ions into the cell， promoting the decrease of Caspase-3 expression， and thus reducing the occurrence of apoptosis.

Key words：Zinc ion chelator;Anti-NMDA receptor encephalitis;Neurons

抗N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體腦炎是一種神經系統免疫性疾病，若治療不及時，會嚴重地威脅患者生命安全[1]。鋅是一種對維持神經細胞正常功能必需的微量元素，生理濃度的鋅可維持神經細胞的正常功能，但鋅離子在細胞內濃度過高，則會對神經細胞造成損害[2]。有研究表明[3]，鋅離子螯合劑（tetrakis pyridylmethyl ethylenedia，TPEN）可以與游離鋅離子形成復合物，并且減少神經元細胞對鋅離子的攝取，減輕海馬神經元的缺血性損傷。本研究通過建立體外神經細胞損傷模型，觀察TPEN干預神經元損傷的作用及機制，以期為抗NMDA受體腦炎提供新的研究靶點，現報道如下。

1材料和方法

1.1實驗動物? 清潔級成年Wistar大鼠40只，2～3月齡，體質量200～250 g，由南昌大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（贛）2015-0001。選擇Wistar大鼠培養神經元細胞，隨機分為TPEN組、ZnSO4組、對照組和正常組4組，各10只大鼠;同時，每組設立24﹑48和72 h共3個時間點，每個時間點15個標本。

1.2方法

1.2.1細胞培養? 選擇Wistar大鼠，酒精消毒后，仔細分離出大腦海馬，剪碎后，胰蛋白酶濃液消化成小塊，胎牛血清終止反應后，調節細胞液濃度為1×105/ml，接種于細胞培養板中。培養10天后，再進行神經元鑒定。

1.2.2神經細胞損傷模型? 細胞培養第10天，將細胞分為對照組及不同濃度谷氨酸組，谷氨酸濃度分別為100、200、300、400 μmol/L。對照組加入緩沖液處理，谷氨酸作用于神經元15 min后更換細胞培養液，細胞培養24 h后，進行神經元臺盼藍染色和TUNEL細胞凋亡檢測。

1.2.3細胞存活率檢測? 采用臺盼藍染色神經細胞后，死亡細胞被染成藍色，存活細胞不著色。隨機計數15個細胞視野，計數染成藍色的神經細胞數及不著色的細胞數，細胞存活率（%）=（存活細胞數/細胞總數）×100%。

1.2.4細胞凋亡率檢測? 采用TUNEL方法檢測細胞凋亡，凋亡細胞被染成深棕色，存活細胞不著色。隨機計數15個細胞視野，計數染成深棕色的神經細胞數及不著色的細胞數，細胞凋亡率（%）=（凋亡細胞數/細胞總數）×100%。

1.2.5 Caspase-3基因檢測? 采用細胞免疫組化法，Caspase-3陽性細胞被染成棕色，隨機計數15個視野，計數棕色細胞數和總細胞數，Caspase-3陽性率（%）=（棕色細胞數/細胞總數）×100%。

1.2.6 TPEN干預神經元損傷? 把神經細胞分為ZnSO4組﹑TPEN組、對照組和正常組4組，每組分24﹑48和72 h時間點，每個時間點計數15個標本。在加入谷氨酸誘導前1 d，分別加入ZnSO4（50 μmol/L）和TPEN（2.5 μmol/L），對照組中加入相同劑量緩沖液，正常組不加入任何液體。神經細胞培養第10天，將100 μmol/L谷氨酸加入ZnSO4組﹑TPEN組和對照組細胞中，15 min后換回正常神經元培養液，正常組細胞不加入任何液體。繼續培養細胞至24﹑48和72 h進行神經元存活率、凋亡率和Caspase-3基因檢測。

1.2.7細胞內鋅離子含量的檢測? 神經細胞培養第10天，ZnSO4組﹑TPEN組和對照組中加入100 μmol/L谷氨酸，15 min后換回正常細胞培養液，繼續培養細胞至24﹑48和72 h，進行鋅離子含量細胞檢測。

1.3統計學方法? 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計數據分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1原代神經細胞培養及鑒定? 神經元接種在細胞培養瓶后，24 h后可見大多數細胞已經貼壁，少數細胞可見神經軸突長出;48 h后大多數細胞有軸突生長;72 h后神經元胞體變大;細胞培養至第8天，神經元軸突相互連接成網狀;培養第10天，進行神經元微管相關蛋-2（MAP2）免疫熒光鑒定，熒光顯微鏡下可見紅色的MAP2陽性神經元胞體及其突起，其中胞體較大，突起細長，見圖1。

2.2體外神經元細胞損傷模型? 采用臺盼藍染色神經細胞后，24 h后可見腫脹神經元細胞裂解，隨著谷氨酸濃度升高，細胞存活率逐漸下降，見圖2。采用TUNEL試劑盒檢測，24 h后可見凋亡的神經細胞體積變小，神經元胞核固縮，在谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時，細胞凋亡率隨著谷氨酸濃度升高而上升;在谷氨酸濃度為200﹑300﹑400 μmol/L時，神經元凋亡率隨著濃度上升而下降，見表1。

2.3 TPEN干預神經元損傷作用

2.3.1神經細胞凋亡率? 神經細胞凋亡后，采用TUNE試劑盒進行檢測，可見凋亡的神經元胞核呈棕色，神經元體積變小，胞核固縮，見圖3。凋亡后24、48、72 h，TPEN組、ZnSO4組及對照組神經元凋亡率高于正常組，且TPEN組神經元凋亡率低于ZnSO4組及對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3.2細胞存活率? 谷氨酸誘導凋亡后，可見神經元細胞腫脹裂解，突起消失，見圖4;采用臺盼藍染色神經細胞，隨機計數細胞存活率，凋亡后24、48、72 h，TPEN組、ZnSO4組及對照組神經元存活率低于正常組，且TPEN組神經元存活率高于ZnSO4組及對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.3.3 Caspase-3基因表達? 采用細胞免疫組化技術，Caspase-3陽性細胞被染成棕色，突起消失，見圖5;凋亡后24、48、72 h，TPEN組、ZnSO4組及對照組Caspase-3陽性率高于正常組，且TPEN組Caspase-3陽性率低于ZnSO4組及對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表4。

2.3.4細胞內鋅離子含量的檢測? 谷氨酸誘導凋亡后，采用鋅離子熒光探針技術，熒光顯微鏡下可見綠色的鋅離子陽性細胞，見圖6;隨機計數鋅離子陽性細胞，結果顯示培養后24、48、72 h，TPEN組鋅離子陽性細胞數低于對照組及ZnSO4組，差異有統計學意義（P<0.05），見表5。

3討論

NMDA受體腦炎是一種主要累及大腦邊緣系統的免疫性腦炎，可以急性或亞急性起病。NMDA受體是谷氨酸通道受體，當通道異常失活可導致癲癇發作及記憶力下降等癥狀[4]。Jun JS等[5]研究表明，在反復驚厥發作的大鼠神經細胞中存在鋅離子相關基因表達，其中鋅轉運體ZnT-1、ZnT-2表達量減少，而鋅離子流入蛋白Zip-6、Zip-7表達量增加，提示在驚厥過程中存在鋅離子向細胞內的流動。當鋅離子流向細胞內則會損傷神經細胞，導致神經細胞的凋亡[6]。有研究表明[7]，使用TPEN可以減輕腦卒中后的海馬神經元損傷。Pruss H等[8]研究表明，在全腦缺血大鼠模型注射鋅離子螯合劑后神經元凋亡率明顯降低。TPEN（金屬離子螯合物）含有可作為電子供體的吡啶基團，是一種膜滲透性特異性鋅螯合劑，可以不受限制地通過神經細胞膜，可以用來螫合神經細胞內鋅離子，從而抑制鋅離子向細胞內的流動。

本研究在谷氨酸誘導神經元凋亡前，將鋅螯合劑TPEN加入到培養好的神經元中，觀察TPEN對神經元的保護作用，鋅離子熒光探針結果顯示，呈現綠色熒光的細胞為鋅離子陽性細胞，凋亡后24、48、72 h，TPEN組鋅離子陽性細胞率低于ZnSO4組及對照組（P<0.05），提示TPEN可以螯合神經元內的游離鋅離子，抑制鋅離子流向細胞內，從而降低細胞內的鋅離子濃度;TPEN組凋亡基因Caspase-3陽性率低于ZnSO4組及對照組（P<0.05），提示TPEN可抑制Caspase-3的表達;TUNE凋亡檢測顯示，TPEN組神經元凋亡率低于ZnSO4組及對照組（P<0.05），提示TPEN可能通過抑制Caspase-3的表達，減少神經元的凋亡;臺盼藍染色檢測顯示，TPEN組神經元存活率高于ZnSO4組及對照組（P<0.05），提示在神經元中加入TPEN后，鋅離子陽性神經元數量及神經元凋亡率減少，而神經元存活率升高，說明TPEN對神經元具有保護作用，而其發揮保護作用的機制可能是通過抑制神經元對鋅離子的攝取，減少鋅離子向神經細胞內流動，抑制凋亡基因Caspase-3的表達，進而減輕對神經元的損傷。

綜上所述，鋅離子螯合劑對NMDA受體腦炎導致的神經元損傷有保護作用，可能是通過抑制鋅離子流向細胞內，減少細胞凋亡的發生，從而對神經細胞起到保護作用。

參考文獻：

[1]Dong Y，Kalueff AV，Song C.N-methyl-d-aspartate receptor-mediated calcium overload and endoplasmic reticulum stress are involved interleukin-induced neuronal apoptosisin rat hippocampus[J].Neuroimmunol，2017，307（15）：7-13.

[2]Sayin U，Hutchinson E，Meyerand ME.Age-dependent long-term structural and functional effects of early-life seizures：Evidence for a hippocampal critical period influencing plasticity in adulthood[J].Neuroscience，2015，288（12）：120-134.

[3]Tian T，Ni H，Sun BL.Neurobehavioral deficits in a rat model of recurrent neonatal seizures are prevented by a ketogenic diet and correlate with hippocampal Zinc/Lipid transporter signals[J].Biol Trace Elem Res，2015，167（11）：251-258.

[4]Kumari K，Sahni N，Kumari V.Anti-N-Methyl-D-Aspartate-Receptor Encephalitisin Young Females[J].Anaesthesiol Reanim，2017，45（6）：377-379.

[5]Jun JS，Seo HG，Lee ST.Botulinum toxin treatment for hypersalivation in anti-NMDA receptor encephalitis[J].Ann Clin Transl Neurol，2017，4（11）：830-834.

[6]Li C，Liu C，Lin F.Anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitisassociated with mediastinal teratoma：a rare case report and literature review[J].Thorac Discovery，2017，9（12）：1118-1121.

[7]Phillips GD，Jones GN，Callaghan M.Hemiataxia：A Novel Presentation of Anti-NMDA Receptor Antibody Mediated Encephalitisin an Adolescent[J].Case Report Psychiatry，2017，69（12）：25-28.

[8]Pruss H，Finke C.N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in herpes simplex encephalitis[J].Ann Neurol，2012，72（2）：902-904.

收稿日期：2020-02-24;修回日期：2020-04-01

編輯/成森