流行性乙型腦炎病毒NS4B蛋白的原核表達及其結構分析

童劍軍 何川川 米麗開姆·托合提尼亞孜 張雪萍 段彥祥 李有文，2*

(1 塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾843300）

（2 新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾843300）

（3 塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾843300）

流行性乙型腦炎(Epidemic encephalitis type B)，簡稱乙腦，于1934年在日本發現，因此又被稱為日本乙型腦炎（Japanese encephalitis）。該病作為一種人獸共患傳染病，早已引起了業內外人士的廣泛關注。本病主要流行于東南亞等地區，典型癥狀表現為意識障礙、體溫升高，昏迷，更甚者可出現神經性癥狀［1，2］，在家畜中尤以豬感染最為嚴重［3，4］。主要表現為突然發病，體溫呈稽留狀態。妊娠期母豬出現高熱、流產、死胎等癥狀，公豬則出現生殖障礙［5，6］，嚴重影響了我國畜牧產業的健康發展。世界衛生組織也將其列為重點防控對象［7］。

乙型腦炎病毒作為黃病毒科的一種單鏈RNA病毒，由11 000 個核苷酸所構成，含有一個特殊結構---多聚蛋白編碼框。該框能夠編碼三種結構蛋白（C、M、E）以及七種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）［8］，而其中的NS4B 蛋白在病毒復制過程中發揮重要作用［2］。據有關資料顯示，黃病毒科病毒由膜相關的復合體介導復制，ns4b 與ns2a、ns2b 和ns4a 三種基因共同構成該復合體［9］。但其他黃病毒科病毒的研究結果顯示，ns4b與內質網相關性更高，然而其相關機制尚不明確。Tajima 等人認為黃病毒科中NS4A 與NS4B 發生互作［10］，但Yu 等卻發現在Vero 細胞中，西尼羅河病毒（West Nile Virus）的NS4A 與NS4B 未互作［11］。由此可知在整個黃病毒科中，不同病毒種的非結構蛋白作用方式差異顯著。NS4B 蛋白自身就是一個典型的跨膜蛋白，有三個跨膜區域，來回穿梭于膜中，其可能對膜的活性、膜的物質和能量交換意義重大。在其致病過程中，病毒自身的蛋白質功能起著關鍵的作用，但我們對JEV 的NS4B 蛋白的功能知之甚少，為研究NS4B 蛋白的功能并進一步揭示其分子作用機制，本研究擬獲得乙型腦炎P3 株ns4b 基因的重組表達蛋白，預測蛋白性質和功能，以期進一步研究該蛋白的功能。

1 材料

1.1 菌種與載體

乙腦病毒P3 株由華中農業大學曹勝波教授饋贈；大腸桿菌DH5α、BL21 以及原核表達載體均保存于新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室。

1.2 主要藥品及試劑

Primestar HS DNA Polymerase、dNTP、T4 DNA 連接酶(購自大連寶生物科技有限公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購買北京天根生物工程技術服務有限公司)，Nde I、Xho I(購自Thermo 公司)，DNA 純化試劑盒(購自美國Omega 公司)。其他試劑按說明書配制。

1.3 主要使用儀器

DYY-12 瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司），全自動凝膠成像分析儀、HC 高電流電泳儀、T100Thermal Cycler 梯度PCR 儀、Mini-PROTEAN Tetra 電泳槽、Mini-Trans-Blot 電泳轉印槽（Bio-Rad生命科學有限公司），XMTP-204 梯三孔三溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），SWCJ-2FD 超凈工作臺（BXOXUN）等。

2 方法

2.1 原核表達載體的構建

2.1.1 ns4b基因特異性引物設計

參考GenBank 中公布的乙型腦炎病毒JaOArS982 參考株(登錄號：NC001437)4B 基因序列，用DNAstar 軟件設計特異性引物，送公司合成。如表1(下劃線為加入酶切位點：Nde I/Xho I)。

表1 引物合成表

2.1.2 ns4b基因的PCR擴增與產物回收

以乙型腦炎病毒P3 株基因組cDNA 為模板，進行PCR 擴增。PCR 產物純化回收并鑒定（按試劑盒說明書操作）。

2.1.3 原核表達載體pET-42b-NS4B的構建及鑒定

用Nde I 和Xho I 雙酶切pET-42b 質粒和回收的PCR 產物，酶切后產物利用DNA 純化試劑盒純化并收集。將二者連接后轉入大腸桿菌感受態DH5α，涂板培養篩選獲得陽性菌提取質粒，并用雙酶切（Nde I/Xho I）鑒定，質粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

2.2 NS4B蛋白表達鑒定

將陽性克隆質粒轉化至感受態細胞BL21，對其表達產物進行SDS-PAGE 電泳，并進行Western Blot檢測，具體參照李有文［12］的方法。

2.3 NS4B蛋白的生物信息學分析

2.3.1 蛋白信號肽及跨膜結構的預測

NS4B 蛋白信號肽的預測，使用在線軟件服務器SignalP4. 1Server，網址為http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/；NS4B 蛋白跨膜結構的預測，使用在線軟件服務器TMHMMServerv. 2. 0，網址為http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/。

2.3.2 蛋白糖基化位點、磷酸化位點和抗原決定簇的預測

NS4B 蛋白糖基化位點和磷酸化位點的分析預測，使用在線軟件服務器NetOGlyc4. 0Server(http://www. cbs. dtu. dk/services/NetOGlyc/)和NetPhos3.1Server(http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/)。NS4B 蛋白質抗原決定簇的預測，使用在線軟件服務器PredictingAntigenicPeptides，網 址 為http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl。

2.3.3蛋白質抗原指數和β-turn的預測

NS4B 蛋白抗原指數和β-turn 的預測，使用在線軟件服務器IEDB，預測的網址為http://www. iedb.org。

2.3.4蛋白質親水性和柔韌性的預測

NS4B 蛋白親（疏）水性和柔韌性的預測，使用在線軟件服務器ProtScale 和IEDB，預測的網址分別為http://web. expasy. org / protscale/和http://www. iedb.org。

2.3.5蛋白二級結構和三級結構的分析預測

對于NS4B 蛋白二級結構分析及預測，使用在線軟件服務器SOPMA(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)和GalaxyTBM(http://galaxy. seoklab. org/)；對 于蛋白質三級結構的分析預測及立體模型構建，使用在線軟件服務器Phyre2，網址為http://www. sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index。

3 結果與分析

3.1 ns4b基因的擴增

以JEV P3株的基因組為模板PCR 擴增的ns4b基因經瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果(圖1)，在近800 bp處有一條帶，與預期大小相符。

圖1 ns4b基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

3.2 NS4B蛋白原核表達載體鑒定

3.2.1 酶切鑒定

經菌液PCR 鑒定，將陽性菌提取質粒并Nde I/Xho I 的雙酶切鑒定，結果得到了與理論相符的載體和目的基因兩條帶(圖2)，鑒定為陽性克隆。

圖2 pET-42b-NS4B質粒雙酶切（Nde IXho I）

3.2.2 測序結果

將鑒定正確的單菌落37 ℃過夜培養，提取重組質粒pET-42b-NS4B，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定，結果表明P3 株NS4B 基因全長765 bp，與參考株同源性99%以上，編碼255 個氨基酸，測序結果見表2。

表2 ns4b核苷酸和氨基酸序列

3.3 ns4b遺傳進化序列分析

根據P3 株測序結果與GenBank 中發表的JEVns4b 的序列進行遺傳進化分析(圖3)，可見ns4b 基因已發現的25 個毒株的遺傳距離很小，只有0.8，說明其親緣關系較近，其中P3 株該基因與JEV strain HW和JEV isolate JEV-hubei 親緣關系最近，說明ns4b 基因非常保守，對病毒生長繁殖作用重大。

圖3 ns4b遺傳進化序列分析

3.4 NS4B蛋白的表達

3.4.1 SDS-PAGE 鑒定

將正確克隆的質粒轉化BL21 并誘導表達的蛋白，經SDS-PAGE凝膠電泳檢測。結果顯示：NS4B蛋白與His 標簽融合表達了27 KDa 的蛋白(圖4)，以包涵體形式表達在沉淀中，上清中含量很低。

圖4 pET-42b-NS4B蛋白表達

3.4.2 Western Blot檢測

以His 單抗進行Western blot 檢測其His 融合蛋白的表達(圖5)，于25 KDa-35 KDa 處出現蛋白印跡，說明融合表達成功。

圖5 Western blot結果

3.5 NS4B蛋白生物信息學分析結果

3.5.1 信號肽與跨膜結構的預測結果

NS4B 無信號肽（圖6）。NS4B 為膜蛋白，有255個氨基酸，1-90aa 表示在膜內區；91-113aa 表示跨膜區；113-251aa表示膜外區，有138個氨基酸殘基在膜外區（圖7），說明NS4B確實是一個跨膜蛋白。

圖6 NS4B蛋白信號肽預測

圖7 NS4B蛋白跨膜結構預測

3.5.2 糖基化位點、磷酸化位點和抗原決定簇的預測結果

NS4B 蛋白共有26 個磷酸化位點(第11、20、23、44、45、49、58、60、64、67、70、74、103、137、153、162、178、190、202、204、211、216、220、229、239、249 位氨基酸)（圖8）。NS4B 蛋白擁有10 個抗原決定簇，第26～34 位 氨 基 酸(PSMALDLRP)、第36～68 位 氨 基 酸(TAWALYGGSTVVLTPLLKHLITSEYVTTSLASI)、 第71～106位氨基酸(QAGSLFVLPRGVPFTDLDLTVGLVFLGCWGQITLTT)、第108～120 位 氨 基 酸(LTAMVLATLHYGY)、第126～132 位氨基酸(QAEALRA)和第142～149 位氨基酸(MKNAVVDG)、第151～157 位氨基酸（VATDVPE）、第168～190 位 氨 基 酸（KVGQVLLIGVSVAAFLVNPNVTT）、第192～203 位氨基酸（REAGVLVTAATL）、第219～233 位氨基酸（ATGLCHVMRGSYLAG）（圖9）。

圖8 NS4B蛋白磷酸化位點的預測

圖9 NS4B蛋白抗原決定簇的預測

3.5.3 蛋白質抗原指數和β-turn的預測結果

NS4B 蛋白抗原指數最高為1.213（圖10）；NS4B蛋白β-turn結構最高分值為1.236，主要分布于242～248位氨基酸（圖11）。

圖10 NS4B蛋白抗原指數分析結果

圖11 β-turn 預測結果

3.5.4蛋白質親水性和柔韌性的預測結果

分值高的氨基酸為第14～21 位氨基酸，第207～245 位氨基酸，得分最高為5. 586（圖12）；分值高的氨基酸區段主要為第13～21 位氨基酸、第40～46 位氨基酸、第67～76位氨基酸、第214～221氨基酸、第242～250氨基酸，分值最高為1.069（圖13）。

圖12 NS4B蛋白親水性預測結果

圖13 NS4B蛋白柔韌性的預測結果

3.5.5 蛋白二級結構和三級結構的預測結果

NS4B 蛋白中共有129 個氨基酸構成α 螺旋，占總氨基酸數的51. 39%；有35 個氨基酸構成了延伸鏈，占總氨基酸數的13.94%；有17個氨基酸構成了β轉角，占總氨基酸數的6.77%；有70個氨基酸構成無規則卷曲，占總氨基酸數的27.89%（圖14）。在線軟件服務器Phyre2 預測構建了NS4B 蛋白的三級結構模型（圖15）。

圖14 NS4B 蛋白二級結構的預測

圖15 NS4B 蛋白三級結構的預測

4 討論

JEV 屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種重要的神經性疾病病原，一直為人們所重視。由于黃病毒屬多聚蛋白編碼框的存在，使很多蛋白功能較為復雜。據研究，黃病毒屬的非結構蛋白NS4B 不僅參與病毒的組裝與復制，而且具有潛在的抗病毒靶點作用；另外，NS4B 可與另一個跨膜蛋白NS4A 通過2 KDa大小的信號肽連接形成異源二聚體而誘導膜重排［13］；還有，NS4B 蛋白能通過誘導宿主細胞的線粒體變性抑制先天性免疫反應［14］。

本研究擴增了JEV 的P3 株ns4b 基因，其系統進化樹結果顯示，JEV 雖為RNA 病毒，但其NS4B 基因的保守性較強，與目前基因庫中登錄的25 株病毒該基因的核酸序列同源性為98. 8%以上，遺傳距離僅0.8，說明NS4B 蛋白組成相當穩定，可能對病毒生長繁殖發揮重要作用。這與黃病毒屬NS4B 蛋白參與病毒的組裝與復制的重要功能相一致。JEV-NS4B含有26 個磷酸化位點，是一個磷蛋白。磷酸化能介導蛋白活性［15］，增強蛋白相互作用的能力，因此推測JEV-NS4B 蛋白是一個活性很強的蛋白。現研究結果證明，NS4B 蛋白不僅可以自身相互作用形成同源二聚體，還可以與NS4A 蛋白通過2 KDa 信號肽連接形成異源二聚體，還可以與NS3 解旋酶相互作用［13］。這些蛋白間的相互作用是病毒復制復合體形成的分子基礎，對病毒的復制至關重要［11，16，17］，特別是NS4B蛋白與病毒的其他蛋白互作形成二聚體可以形成病毒復制泡，促進病毒增殖。但是對丙肝病毒（HCV）NS4B 蛋白研究發現其能通過其膜外區以及C 端的氨基酸發生自身互作，形成同源二聚體，破壞HCV NS4B二聚體的形成，能夠影響復制泡的形成，抑制病毒復制［18-20］。從這個角度考慮有望利用NS4B蛋白的自聚合來抑制病毒增殖而控制疫病。

經預測JEV-NS4B 蛋白具有3 個跨膜區域，是一個標準的跨膜蛋白，原核表達得到不溶性的大小約為27 KDa 的蛋白，與其他黃病毒屬該蛋白疏水性非結構膜蛋白的特性一致［8］。膜蛋白的功能之一就是作為轉運體，轉運體是細胞內外物質轉運的分子基礎，包括離子轉運體、神經遞質轉運體、營養物質轉運體以及外來物質轉運體。有些藥物可通過對某種轉運體的抑制作用而產生效應，因此轉運體可以作為藥物靶標用于疾病治療。NS4B蛋白就可作為治療黃病毒感染的一個新型藥物靶標［21］。研究表明，化合物NITD-618 能夠靶向登革熱病毒（DENV）的NS4B 蛋白，對DENV 具有明顯的抑制效果，其EC50在低至1.0μmol，但該化合物對WNV、YFV等其他黃病毒無效［22］。馬尼地平的病毒靶點是位于JEV 非結構蛋白NS4B 的130 位谷氨酰胺（Q），Q130 突變成正電氨基酸精氨酸（R）或賴氨酸（K），突變病毒對馬尼地平不敏感［23］。化合物CCG-3394和CCG-4088也能靶向NS4B 蛋白，抑制黃熱病毒（YFV）的復制［24］。因此加緊對NS4B 蛋白生物學特性和免疫特性的研究，才能更好地利用NS4B 靶標，開發更多更好的藥物治療黃病毒感染。

信號肽多由15～30個氨基酸組成，對蛋白質跨膜轉移（定位）的N-末端的氨基酸序列有重要指導意義，在蛋白成熟后信號肽自然脫落，保證蛋白基本功能［25］。對JEV-NS4B 蛋白的氨基酸序列進行生物信息學分析發現其不含有信號肽，但是有研究表明黃病毒的NS4B 可與另一個跨膜蛋白NS4A 通過2 KDa大小的信號肽連接形成異源二聚體而誘導膜重排［13］，利于病毒的復制。資料顯示JEV-NS4A蛋白也不含有信號肽，這個二聚體的形成機制還有必要進一步研究。有關文獻報道，信號肽結構有利于提高蛋白質的可溶性［26］，無信號肽結構的蛋白易因可溶性低而更易形成包涵體。這也提示如果要得到高質量大量表達的該蛋白，在構建時加一個信號肽可能會有較好的效果。NS4B 蛋白擁有10 個抗原決定簇，且含有17 個氨基酸組成可被稱為環（loop 區）的β 轉角，該區為功能性抗體的識別位點的可能性很大［27］，由此推測NS4B 蛋白具有功能性抗原的潛質，可作為未來抗體的備選作用靶點，也能為乙型腦炎疫苗的研發提供多重選擇。NS4B 蛋白的柔韌性較為優良，二級結構內α-螺旋結構占比高達51.39%，其穩定性可見一斑，可為篩選蛋白環節提供便利，提高抗體生產效率，加快疫苗研發進程；β 折疊和無規則卷曲區域的二級結構較為松散，更易于盤旋和扭曲，該區域可能存在優勢抗原表位［28］，更容易與抗體分子結合，可有效促使機體產生免疫反應［29］，提高其抗病力，縮短病程。本試驗通過對乙型腦炎病毒NS4B 蛋白生物學信息分析，為后期更深入研究乙型腦炎病毒并發掘其潛在功能提供參考。