應用SSR標記鑒定甜瓜流星翡翠的種子純度

武婷，郭誠，巫水欽，俞洋，鐘六鳳，俞金龍

(浙江美之奧種業股份有限公司，浙江 嘉興 314000)

甜瓜(CucumismeloL.)是世界上重要的高產出、高效益果用蔬菜作物，在世界各地廣泛種植，我國是世界甜瓜生產與消費第一大國。甜瓜為異花授粉植物，生產的商品種絕大部分為雜交種，而雜交種在制種過程中，容易因去雄不徹底導致自花授粉，從而降低種子純度。甜瓜的種子純度直接影響著甜瓜的品質和產量，對農民的生產種植收益甚為重要。因此，雜交種種子真實性和純度鑒定是評價甜瓜種子質量最主要的因素[1]。

目前，甜瓜雜交種純度鑒定的傳統方法是田間鑒定，此方法主要是根據形態學特征進行鑒定，其鑒定周期長、費工費力、成本高，且易受環境因素影響。隨著分子標記技術的發展與應用，簡單重復序列標記(SSR標記)具有共顯性遺傳、多態性高、數量豐富、不易受環境因素影響等特點而被廣泛應用，SSR標記能夠高效、準確地對種子純度做出鑒定[2]。本研究利用來自公開發表的文獻和葫蘆科作物數據庫的124對SSR標記引物，篩選甜瓜流星翡翠及其父母本材料間數對多態性引物，用于流星翡翠雜交種純度鑒定，以期建立一套高效、準確、成本低的室內雜交種種子純度檢測技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為甜瓜雜交種流星翡翠及其親本種子，由浙江美之奧種業股份有限公司自主選育。

1.2 方法

1.2.1 浸種催芽育苗

50 ℃水浴浸種20 min，再用自來水清洗，然后將種子用濕毛巾包裹，放置于保濕盤中，于恒溫培養箱中30 ℃催芽(暗)，胚根2 cm左右時進行穴盤播種育苗。

1.2.2 DNA提取

以288份流星翡翠F1代單株及其親本材料各12株為樣本，取其幼嫩葉片1 cm2左右于2 mL離心管中。采用SDS抽提法提取基因組DNA[3]，使用超微量紫外分光光度計NanoDrop One檢測DNA濃度和質量，于4 ℃保存。

1.2.3 PCR擴增與電泳檢測

124對SSR標記引物來自公開發表的文獻和葫蘆科作物數據庫，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系(20 μL)：DNA模板2 μL(≈200 ng)，上下游引物各2 μL(10 μmol·L-1)，2×FTaqMasterMix(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)10 μL，加ddH2O至體積20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴增產物采用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 種子純度鑒定分析

利用能有效區分雜交種和父母本的多態性SSR標記引物，進行雜交種F1代種子純度鑒定。根據擴增PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳帶型，統計具有父母本特征條帶的個體數量，鑒定為有效雜交種，反之為假雜種，并計算雜交種純度。雜交種純度=(同時具有父母本條帶的株數/檢測的總株數)×100%。

2 結果與分析

2.1 多態性引物篩選

利用124對SSR標記引物對甜瓜流星翡翠及其父母本材料進行DNA擴增，4%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，篩選親本間具有條帶清晰、多態性差異明顯且可穩定重復的引物。結果如圖1所示，獲得多態性標記引物共3對，分別為GCM90(F: 3′-GGGTGGATTCACTATTTGC-5′；R: 3′-TTAATCTGG CCGCTTATTC-5′)、GCM92(F: 3′-CAGAAATTTTG GCCTGAAC-5′；R: 3′-CCTGAGTTATTGCAGAGGG-5′)和GCM119(F: 3′-TATTATCCAACGCCTGTCC-5′；R: 3′-CCTGAGTTATTGCAGAGGG-5′)。這3對引物擴增的譜帶易于區分親本和雜交種，各引物擴增的親本材料均為差異的單條帶，雜交種為父母本互補的雙條帶，符合實驗種子純度鑒定要求，可以用來鑒定流星翡翠雜交種的種子純度。

M為100 bp DNA Ladder；泳道1～6為GCM90引物擴增結果；泳道7～12為GCM92引物擴增結果；泳道13～18為GCM119引物擴增結果；泳道1、2、7、8、13和14為父本材料；泳道3、4、9、10、15和16為母本材料；泳道5、6、11、12、17和18為流星翡翠雜交種材料。圖1 三對SSR引物在甜瓜流星翡翠及其親本材料中的擴增結果

2.2 甜瓜流星翡翠的種子純度鑒定

使用GCM90、GCM92和GCM119多態性SSR引物對流星翡翠雜交種進行種子純度鑒定，共檢測株數288份，結果如圖2所示。這3對SSR引物均擴增到1份材料為單條帶，且為同一份，這份材料為母本型條帶。因此該批次流星翡翠的種子純度為99.65%。出現1份材料為假雜種的原因可能為制種過程中去雄工作不徹底，導致母本自交結實。

M為100 bp DNA Ladder；泳道1～24為流星翡翠雜交種材料。圖2 引物GCM90、GCM92、GCM119對甜瓜流星翡翠材料的擴增結果

3 小結與討論

農作物種子純度鑒定主要有傳統的田間農藝性狀調查和室內分子標記技術快速檢測。傳統的田間品種純度鑒定周期長，耗時耗人工，成本高，且易受環境條件影響，純度準確度有所偏差。相比之下，DNA分子標記鑒定效率高，穩定性好，只需要剝去殼的種子、胚根或者苗期的幼嫩葉片就可以作為材料用于純度鑒定，省時省力，精確度高。甜瓜流星翡翠分別于2018、2019年進行品種試驗和展示。種植戶反饋田間觀察出現個別皮色不一致瓜果，純度達99%以上，在種子純度合格范圍。本研究SSR標記純度鑒定結果與田間純度調查結果基本一致。

SSR標記呈共顯性遺傳，可區分雜合種和自交種，數量豐富，具有多態性高、重復性好、結果穩定高效等諸多優點[4]，廣泛地應用于分子標記輔助育種、DNA指紋圖譜庫的構建和品種鑒定等研究。目前，甜瓜制種的主要措施仍然是人工去雄授粉，在雜交制種過程中去雄不徹底，易獲得自交種子，與雜交種子混雜，導致雜交種純度一般達不到100%[5]。為保證種子質量，保障農民經濟效益，雜交種純度鑒定和真實性鑒定是一項重要的指標。本研究用124對SSR標記引物對甜瓜流星翡翠雜交種和親本進行擴增，篩選到3對多態性引物，可用于流星翡翠雜交種純度鑒定。多對引物組合鑒定，可進一步保證檢測的準確性。本研究還表明，瓊脂糖凝膠濃度為4%時，親本間擴增片段差異區分效果好，能獲得更多的多態性標記。