AtNPR1和Cecropin B基因共表達載體的構建

孫立方，柯甫志，聶振朋，王平，孫建華，徐建國

(浙江省柑橘研究所，國家柑橘品種改良中心浙江分中心，浙江 臺州 318026)

柑橘病害嚴重影響其外觀、品質和產量，對柑橘生產極為不利。目前，針對柑橘病害采取的措施以利用化學農藥為主。篩選抗病品種的柑橘育種有助于品種改良，但存在周期較長、效率低等缺點，而轉基因技術等基因工程育種方法能克服傳統育種的缺點[1]。利用轉基因技術聚合多個抗病基因可顯著提高植物的抗病性。在多基因共表達植物載體構建中，以鳳仙花種子的一段多肽LP4和有自我剪切功能的口蹄疫病毒片段2A作為連接肽進行多基因融合是一種可以替代傳統多基因轉化方法的新手段，可以同時連接多個基因并且協同表達[2-5]。而將LP4和2A多肽連接形成新的多肽LP4/2A具兩者優勢，是一種更為有效的多基因轉化連接肽[4, 6-8]。擬南芥中的廣譜抗病基因AtNPR1和抗菌肽CecropinB基因已分別在多種作物中被證實具有較好的抗病效果[9-10]。因此，本研究將利用基因聚合育種技術來探索提高柑橘對細菌性和病毒性等病害的抗性，利用LP4/2 A作為連接肽，構建AtNPR1和CecropinB基因的共表達植物載體，為后期轉化柑橘獲得抗病材料做準備。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

本實驗所用載體pBI121購買于北京華越洋生物科技有限公司。大腸埃希菌DH5a和農桿菌GV3101感受態細胞購于上海唯地生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

本研究使用的試劑有高保真聚合酶KOD-FX (Toyobo)，PCR產物回收試劑盒D6492 (Omega)，In-Fusion HD Cloning Kit (TaKaRa)，連接酶EL0011 (Thermo Fermentas)和內切酶FastDigest (Thermo Fermentas)。

1.3 載體構建

啟動子GRP1.8的編碼序列和連接肽(抗菌肽)LP4/2A-Cecropin B的全長編碼序列由華大基因科技有限公司合成。以實驗室前期構建的質粒為模板重新擴增AtNPR1。利用重疊PCR將AtNPR1和LP4/2A-Cecropin B連接重組為AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因，兩端引入XbaⅠ/BamHⅠ酶切位點，并直接連接到載體pBI121，即獲得35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B載體。利用重疊PCR將GRP1.8和AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B連接重組為GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因，兩端引入HindⅢ/BamHⅠ酶切位點，用無縫連接方式連接到載體pBI121，即獲得GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B載體。反應體系共50 μL，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；最后72 ℃延伸7 min。實驗所用引物由生工生物工程有限公司合成，具體引物列表如下(表1)。

表1 構建所需的引物名稱和引物序列

1.4 根癌農桿菌轉化

取-80 ℃保存的農桿菌GV3101感受態于冰中融化。每100 μL感受態分別加入1 μg左右上述獲得的35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B載體質粒DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5 min、液氮5 min、37 ℃水浴5 min、冰浴5 min。加入700 μL無抗生素的LB液體培養基，于28 ℃振蕩培養2～3 h。6 000 r·min-1離心1 min收菌，留取100 μL左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含Kan和Rif抗生素的LB平板上，倒置放于28 ℃培養箱培養2～3 d。最后隨機挑取單克隆進行PCR驗證。

2 結果與分析

實驗所構建的載體示意圖如下(圖1)。載體啟動子分別為CaMV 35S和韌皮部特異性啟動子GRP1.8。目的基因AtNPR1和CecropinB基因通過連接肽LP4/2 A連接，CecropinB前同時引入信號肽PR1a。實驗預期最終分別獲得35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B植物共表達載體。

圖1 載體的構建情況

2.1 目的基因擴增和重組

以實驗室前期構建的質粒為模板擴增AtNPR1，以人工合成的質粒為模板分別擴增GRP1.8和LP4/2A-Cecropin B片段，分別引入相應酶切位點。設計重疊PCR引物，將AtNPR1和LP4/2A-Cecropin B連接重組為AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因(圖2)。同樣，利用重疊PCR將GRP1.8和重組基因AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B連接，重組為GRP1.8-AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因(圖2)。然后采用酶切連接和無縫連接的方式將這2個重組后的基因分別連接到載體pBI121，下一步進行轉化。

M—Marker DL2000; 1—AtNPR1-LP4/2A-CecropinB (2 082 bp); 2—pGRP1.8: AtNPR1-LP4/2 A-Cecropin B (2 684 bp); 3—pGRP1.8 (626 bp)。圖2 擴增和重組基因凝膠的回收電泳

2.2 載體轉化和PCR檢測

將AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8-AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B連接pBI121后的構建載體分別轉化大腸埃希菌DH5α。用菌液PCR驗證(圖3)，并挑取陽性克隆提取質粒后送公司測序，測序結果顯示2個構建序列均正確。表明35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B植物表達載體構建成功。

35S為AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B 質粒轉化大腸埃希菌DH5α后PCR檢測結果(3、5、6為陽性，5號測序正確)；GRP1.8為AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B質粒轉化大腸埃希菌DH5α后PCR檢測結果(2、5為陽性，2號測序正確)。圖3 構建質粒轉化大腸埃希菌DH5α后PCR檢測結果

挑選上述測序正確的單克隆質粒，分別轉化農桿菌GV3101，最后挑取單克隆進行PCR檢測。結果表明，所選菌落均為陽性克隆，說明轉化成功(圖4)。以上結果表明，所構建的植物表達載體35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B成功轉入農桿菌GV3101。

35S為AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B質粒轉化農桿菌GV3101后PCR檢測結果(1、2為陽性)；GRP1.8為AtNPR1-LP4/2 A-Cecropin B質粒轉化農桿菌GV3101后PCR檢測結果(1、2為陽性)。圖4 轉化農桿菌GV3101后PCR檢測結果

3 討論

以雜交育種為主的作物傳統育種來篩選抗病品種，周期長并且具有很多局限性，柑橘育種也面臨同樣的問題。近些年基因工程技術在柑橘抗病育種廣泛應用，并取得一系列進展。廣譜抗病基因AtNPR1和抗菌肽CecropinB基因在作物抗病育種中取得較好的效果，而且分別在柑橘抗黃龍病和潰瘍病也有應用[11-13]。LP4/2A在作物多基因轉化中被證明可以有效地協調多個基因的共同表達[4,8]。本研究以LP4/2A連接肽為連接肽，成功構建了AtNPR1和CecropinB基因的共表達載體，為以后篩選轉基因抗病柑橘準備材料。通過2個抗病基因共同轉化柑橘，以期進一步提高柑橘的廣譜抗病性。