靈芝全基因組SSR標記開發及其種質資源遺傳多樣性評估

何金宇，劉玉洋，徐靖，王曉彤，陳曉俊，王慧中*，盧江杰*

(1.杭州師范大學 生命與環境科學學院，浙江 杭州 310036； 2.浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310036； 3.浙江省珍稀植物藥工程技術研究中心，浙江 武義 321200； 4.浙江壽仙谷醫藥股份有限公司，浙江 武義 321200)

靈芝(Ganodermalucidum)是我國的傳統中藥材，有“九大仙草”之一的美稱，性微溫，氣味特殊，味微苦澀。早在漢代《神農本草經》就有關于靈芝能“益心氣，安精魂，補肝益氣，堅筋骨”的記載。靈芝在分類地位上隸屬真菌門、擔子菌亞門、層擔子菌綱、無隔擔子菌亞綱、非褶菌目、靈芝菌科、靈芝屬，廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區，在我國主要分布在海南、浙江、云南、貴州等省份。在《中華人民共和國藥典(2015版)》中被收錄為法定中藥，以多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實體入藥，其化學成分較為復雜，主要含有三萜類、多糖類、氨基酸多肽類、核苷類、呋喃類、生物堿類、油脂類及其微量元素類等[1-2]，具有多種生理活性和藥理活性，如調節免疫，預防心血管系統疾病，抗腫瘤，抗病毒，降血糖，抗氧化等[3-4]。

由于靈芝具有很高的藥用價值和經濟價值，市場需求量大，部分商家為獲取暴利未按《食用菌菌種管理辦法》進行生產和銷售，再加上靈芝的長期栽培以及雜交育種導致靈芝分類混亂，菌種名稱不統一，很大程度上阻礙了靈芝產業的良性發展。隨著人民生活水平的提高，對高品質靈芝的需求越來越大，優質新品種培育成為靈芝育種工作的重點和難點，而靈芝種質資源鑒定及遺傳多樣性研究則是靈芝育種工作的前提和基礎。傳統靈芝分類方法主要是形態學鑒定，如趙繼鼎等[5]將靈芝科分為4個屬，3個亞屬和2個亞組，然而在不同的生長環境下，同種靈芝的表型性狀可能會有一定的差異。與傳統的靈芝種質表型鑒定方法相比，分子鑒定從DNA分子層面對靈芝基因組DNA序列進行分析，減小環境和人為因素對靈芝鑒定的影響，有效提高了靈芝鑒定的準確性。

SSR分子標記又稱為微衛星DNA，廣泛存在于真核生物基因組中，其重復單位多數為二堿基和三堿基，少數為四、五、六堿基，每隔10～50 kb就會有一個SSR位點[6]。SSR分子標記具有重復性好、多態性高、數量多、分布廣、共顯性、對模板DNA要求低等優點[7-9]，已廣泛應用于甘草[10]、苦玄參[11]、決明[12]、麥冬[13]等藥用植物的種質資源鑒定以及遺傳多樣性研究。張肖雅等[14]采用ITS和SSR分子標記技術對11株靈芝進行鑒定，結果表明，供試菌株都屬于靈芝種，11個靈芝菌種可分為4個類群，并構建了靈芝菌種的分子身份證。肖自添等[15]利用ISSR分子標記技術對24個靈芝菌株進行遺傳多樣性分析，從43個引物中篩選出了10個多態性好、重復率高的ISSR引物用于靈芝遺傳多樣性研究，通過聚類分析，將24個菌株分為4個組群，研究結果表明，利用ISSR分子標記技術對靈芝菌種進行遺傳多樣性探索是可行的。黃浩等[16]評估了RAPD、18SrDNA和ITS分子標記技術在靈芝品種鑒定中的效果，結果表明，RAPD和ITS標記技術鑒定結果一致，并且與傳統分類結果相同，可用于靈芝種質資源鑒定。靈芝全基因組SSR標記的開發和應用相關的工作較少，因此，開發靈芝全基因組SSR分子標記技術，并利用種質資源鑒定以及遺傳多樣性評估，對評價和保護靈芝現有種質資源，以及優良新品種選育都具有重要意義，更是一定程度上可以促進靈芝產業良性發展。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗材料為浙江壽仙谷珍稀植物藥研究院收集的靈芝種質資源，共有11份，詳細信息如表1所示。將菌種置于試管固體培養基中斜面培養，用于提取靈芝基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

由于靈芝菌絲體細胞壁成分復雜，在提取基因組DNA過程中很難完全裂解，而且菌絲體中含有大量的多糖會干擾DNA的提取，因此，要獲得濃度高、雜質少的靈芝基因組DNA十分困難。本研究改進了傳統的CTAB法，使其適用于靈芝菌絲體基因組DNA的快速提取。具體步驟如下：

表1 供試11份靈芝種質資源的情況

用滅菌的藥匙從培養基上刮取足量的靈芝菌絲體，放入2.0 mL離心管中并加入1粒鋼珠，液氮中浸泡2 min，在研磨儀中以40 Hz的頻率研磨3 min(確保菌絲體細胞壁破碎)。

加入500 μL預熱的CTAB-free溶液(除去多糖)，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心5 min，去上清。

加入500 μL預熱的CTAB溶液和5 μL β-巰基乙醇，振蕩混勻，65 ℃水浴1 h(使菌絲體細胞完全裂解)，每隔5 min顛倒混勻1次。

置于實驗臺上冷卻至室溫后，加入20 μL RNase A(10 mg·mL-1)，混勻后靜置5 min(除去RNA雜質)。

加入500 μL氯仿，置于-20 ℃冰箱5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取500 μL上清液于新的離心管中。

加入500 μL異丙醇，充分混勻后，室溫靜置3 min，10 000 r·min-1離心5 min，棄上清。

加入1 mL 75%的乙醇，顛倒漂洗2 min，10 000 r·min-1離心5 min，棄上清。重復1次。打開離心管蓋子，室溫倒置15 min，(使乙醇完全揮發)。

加入50 μL滅菌的ddH2O充分溶解DNA，置于-20 ℃冰箱保存。

用1%的瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計(NanoDrop2000)檢測靈芝基因組DNA的純度和濃度，并將DNA樣品稀釋至20 ng·μL-1，4 ℃冰箱保存，用于后續實驗。

1.2.2 基因組序列獲得和SSR位點篩選

目前，靈芝基因組測序工作已經完成，Chen等[17]利用二代高通量測序技術和數字化酶切指紋圖譜技術對靈芝菌株260125-1的單倍體核細胞進行測序和組裝，獲得了43.3 Mb的靈芝全基因組圖譜。將靈芝全基因組序列以.fasta文件形式全部下載下來并利用單機版SSR分析程序MISA (MIcroSAtellite)進行靈芝SSR位點的統計和分析。MISA軟件的搜索規則：二核苷酸重復次數至少為6次(總長度不少于12個堿基)；三核苷酸重復次數至少為5次(總長度不少于15個堿基)；四核苷酸重復次數至少為4次(總長度不少于16個堿基)；五核苷酸重復次數至少為3次(總長度不少于15個堿基)；六核苷酸重復次數至少為3次(總長度不少于18個堿基)。

1.2.3 全基因組SSR分子標記引物設計

利用在線引物設計軟件Primer Premier 3.0 (PRIMIER Biosoft International, CA, USA)設計靈芝基因組SSR引物。引物設計的主要參數：引物長度要保證在18～25 bp；不要產生二級結構如dimer，hairpin，falseprimer等；退火溫度要保持在45.0～65.0 ℃；CG含量要保持在40%～70%；PCR擴增產物的長度要在100～300 bp。

1.2.4 真實性SSR引物篩選

隨機選擇50對靈芝基因組SSR引物，送至上海生工生物公司合成。選擇2份靈芝材料的基因組DNA作為模板，對合成的50對引物進行初步篩選，將條帶清晰、多態性豐富、重復性好的引物用于后續實驗。

1.2.5 PCR擴增體系

靈芝PCR擴增體系(10 μL)：10×Buffer(含Mg2+)1 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.3 μL，正向引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，反向引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，Taq酶(2 U·L-1)0.5 μL，靈芝基因組DNA模板(20 ng·μL-1)1 μL，滅菌的ddH2O 6.2 μL。

靈芝PCR擴增反應程序如下：94 ℃預變性3 min，(94 ℃變性30 s，復性40 s，72 ℃延伸90 s)共32個循環，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

1.2.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測及銀染

用無塵紙將玻璃板擦凈后，用夾子夾緊玻璃板兩側，水平放置。

在燒杯中加入6%丙烯酰胺40 mL，10%過硫酸銨280 μL，TEMED 20 μL，充分混勻后，緩慢水平灌膠，插上68孔梳子，靜置30 min至膠完全凝固。

向垂直電泳槽中加入適量1×TBE緩沖液，將盛有PAGE膠的玻璃板放到電泳槽中，固定好后，在垂直電泳槽頂端加入適量1×TBE緩沖液，拔出梳子，取5 μL擴增產物與1 μL 6×loading buffer混均，點樣。180 V恒壓電泳1 h。取出PAGE膠，蒸餾水漂洗3次，加入600 mL 0.1%的AgNO3溶液，銀染10 min，蒸餾水漂洗3次，加入600 mL顯影液和500 μL甲醛溶液，顯影10 min，蒸餾水漂洗3次。將PAGE凝膠移至顯影燈上，拍照。

1.2.7 遺傳多樣性分析

隨機選擇50對靈芝SSR引物，送至上海生工生物公司合成。隨機選擇2個靈芝基因組DNA為模板，對合成的50對引物進行初步篩選，將條帶清晰、多態性豐富、重復性好的引物用于后續實驗。

2 結果與分析

2.1 靈芝全基因組SSR位點情況

經過生物信息學分析發現其中共有4 038個SSR位點(表2)：其中單堿基重復的SSR位點104個，二堿基重復的SSR位點186個，三堿基重復的SSR位點876個，四堿基重復的SSR位點354個，五堿基重復的SSR位點555個，六堿基重復的SSR位點1 963個。

表2 靈芝全基因組SSR位點信息

此外，如圖1所示：靈芝全基因組的4 038個SSR位點共包含273種類型，其中三堿基重復的ACG類型數量最多，達213個(約占15.2%)；其次是CCG和AGG，分別達172(約占12.3%)和171個(約占12.2%)；前十位多的類型中，二堿基只有AG，共92個，約占6.6%；單堿基只有C，共83個，約占5.9%；四堿基只有AAAC，共59個，約占4.2%；此外還有2個六堿基的ATCCTC和ACGAGG，分別有83個(約占5.9%)和70個(約占5.0%)。

圖1 靈芝基因組序列中SSR標記的類型

2.2 靈芝SSR分子標記開發情況

在4 038個SSR位點中，除去不能用于引物設計的位點后，剩余1 442個位點可用于靈芝SSR引物的設計，共得到1 442對靈芝SSR引物。隨機選擇其中的50對引物用于構建靈芝全基因組SSR標記的開發研究流程，這50對靈芝SSR引物的詳細信息見表3。

2.3 靈芝SSR引物初步篩選結果

利用紫外分光光度計和2%的瓊脂糖凝膠檢測提取的靈芝基因組DNA，結果表明，11份靈芝基因組DNA的濃度和純度都達到了實驗要求，D260/D280的比值在1.8～2.0，濃度在200～300 ng·μL-1，無蛋白質、RNA等雜質的污染且無降解。將DNA母液稀釋至20 ng·μL-1，用于后續的PCR擴增實驗。

表3 50對靈芝SSR引物的信息

續表3

利用2號和3號靈芝菌株的基因組DNA對合成的50對引物進行初步篩選，篩選結果如圖2所示。在50對引物中有清晰條帶的引物有44對，占總數的88%，因此，在我們設計的1 442對靈芝SSR引物中，約有1 268對真實SSR引物，這些引物可用于靈芝的種質資源鑒定和遺傳多樣性研究。

圖2 50對SSR引物篩選的電泳

2.4 靈芝SSR引物擴增電泳圖

利用篩選出的44對靈芝真實SSR引物對11份靈芝菌株進行鑒定，經過PCR擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染等實驗操作后，我們獲得了靈芝的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，擴增產物長度在80～500 bp，部分電泳結果如圖3所示。

2.5 不同靈芝的遺傳多樣性

根據44對靈芝SSR引物的擴增結果，對擴增產物的條帶進行統計，制作等位基因矩陣表，利用Powermarker軟件進行聚類分析。11份靈芝材料間的遺傳距離如表4所示，遺傳距離在0.120～0.962，GL-2號和GL-11號、GL-3號和GL-11號靈芝遺傳距離最大，為0.962；GL-7和GL-8號靈芝遺傳距離最小，為0.120。由圖4可知，11份靈芝材料被分為3類，GL-1-GL-5為第1類，GL-6-GL-9為第2類，GL-10和GL-11為第3類。其中GL-2、

圖3 靈芝擴增產物聚丙烯酰胺的凝膠電泳

表4 各供試材料間的遺傳相似系數

圖4 11份菌株材料SSR標記評估的系統發育樹

GL-3和GL-4靈芝屬于原菌種LZ32同一代家系的不同菌株，GL-8和GL-9靈芝屬于原菌種不明的前后兩個世代的不同家系的不同菌株，他們分別聚類在一起，表明具有較好的遺傳穩定性。但是從材料系譜(表1)來看GL-1-GL-7均是原菌種LZ32不同世代的菌株，理論上應該表型有較一致的遺傳穩定性，但實際上如圖4所示，同為一個世代的GL-5和GL-6卻聚類在不同分支，不同菌株來源的GL-7和GL-8卻有較近的遺傳距離而聚類在一起。說明本實驗的部分靈芝品種在種植過程中發生雜交或突變導致靈芝基因序列發生改變, 其藥理成分是否發生變化需要進一步驗證。此外，野生靈芝菌株GL-10和GL-11在聚類上單獨成第3類，與栽培靈芝GL-1-GL-9表現了相對獨立的位置，說明其保留了很多相對獨立的DNA信息，這對于我們利用野生靈芝菌株來改良現有的栽培品種具有重要意義。

3 小結與討論

在本研究開發的50對靈芝全基因組SSR引物中，有44對引物可擴增出清晰條帶，真實SSR引物所占比例為88%。因此，在全部1 442對SSR引物中，約有1 268對真實SSR可用不同靈芝品種或株系之間的純度和特異性鑒定以及遺傳多樣性研究。本研究利用篩選出的44對靈芝基因組SSR引物對11份靈芝種質資源進行遺傳多樣性評估，結果表明，11份靈芝材料的遺傳距離在0.120～0.962，可分為3大類，然而，其中部分不同品系的靈芝聚類到一起，說明本實驗收集的部分靈芝材料純度較低，可能發生過雜交或基因突變，其藥理成分是否發生改變需要進一步研究。本研究根據靈芝基因組數據開發的SSR引物，將為我們開展靈芝現有品種商業化推廣與鑒定、遺傳改良和品種選育奠定基礎。