大晶帽石斛再生體系建立研究

吳佩珂　林蔚　李菁　王雪妮　范正陽　孫文忠　何碧珠

摘要? ? 本文以成熟度70%原生大晶帽石斛莢果內種子為外植體，探究采用不同消毒時間、培養基成分構成及濃度配比對大晶帽石斛無菌萌發的影響。結果表明，大晶帽石斛莢果用5%次氯酸鈉消毒15 min，可有效降低污染率;將消毒后莢果種子接入MS+蛋白胨2 g/L+NAA 0.5 mg/L+花寶1號2 g/L+0.1%活性炭+ 0.58%瓊脂+2%蔗糖培養基中，種子萌發率達88%，是適宜大晶帽石斛無菌萌發的培養基配方。

關鍵詞? ? 大晶帽石斛;種子;無菌萌發;培養基;消毒時間

中圖分類號? ? Q813.1+2? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）09-0141-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? In this paper，the pods with maturity of 70% of Dendrobium macrocephalum was used as explants to study the effects of disinfection time，different composition and concentration of medium on the aseptic germination of Dendrobium macrocephalum.The results showed that disinfect pods with 5% sodium hypochlorite for 15 minutes could effectively reduce the pollution rate after inoculation.The seeds from the sterilized pod were inserted into the medium of MS+2 g/L peptone+0.5 mg/L NAA+2 g/L Huabao No.1+0.1% active charcoal+0.58% agar+2% sucrose，the seed germination rate could reach 88%.This is a suitable medium formula for aseptic germination of Dendrobium macrocephalum.

Key words? ? Dendrobium macrocephalum;seed;aseptic germination;medium;disinfection time

石斛屬（Dendrobium）為蘭科（Orchidaceae）植物最大屬之一，有1 500余種，在我國有80多種。石斛作為一種名貴中藥材，在我國有悠久的應用歷史。晶帽石斛（Dendrobium crystallinum Rchb. f.）主產于我國云南省，是一種喜濕、喜陰涼的多年生草本植物，多生長在溫暖潮濕的熱帶亞熱帶深山老林的疏松樹皮、樹干上或石縫之中[1]。大晶帽石斛莖直立或斜立，不分枝，具多節，節間長3～4 cm，花朵形態優美，氣味芬芳，花色明艷，具有很高的觀賞價值，被譽為“四大觀賞洋花”之一[2]。

由于石斛特殊的生物特性，種子無胚乳，大晶帽石斛自然繁殖能力低[3]。目前，對大晶帽石斛再生體系的研究較少。本試驗采用成熟度70%野生大晶帽石斛莢果內種子作為外植體，研究不同成分構成培養基及添加物用量對大晶帽石斛種子萌發的影響，探討莢果消毒時間對種子萌發的影響，旨在探究適合大晶帽石斛種子無菌萌發的條件，以期快速建立再生體系，為大晶帽石斛規模化生產提供理論指導依據和技術支持。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

試驗材料為云南文山野生大晶帽石斛莢果，采摘期為2017年12月至2018年1月，莢果皮整體呈綠色，部分泛黃，成熟度為70%[4]。莢果內種子呈綠色粘連塊狀。

1.2? ? 試驗設計

1.2.1? ? 不同添加物對種子萌發的影響。共設4個處理，即添加NAA 0.5 mg/L+花寶1號2.0 g/L+蛋白胨2.0 g/L（A）、NAA 1.0 mg/L+花寶1號2.0 g/L（B）、花寶1號3.0 g/L（C）、蛋白胨3.0 g/L（D）。各個處理均加入MS+0.1%活性炭+瓊脂0.58%+2%蔗糖，調制培養基的pH值為5.7。

1.2.2? ? 不同消毒時間對種子萌發的影響。將預處理后的種子分別浸泡處理消毒8、10、12、15 min。

1.3? ? 試驗方法

1.3.1? ? 莢果預處理。挑選健康無病、蟲害少、顆粒飽滿、色澤均勻的大晶帽石斛莢果，將莢果一端多余過長的果柄切除后置于洗衣粉水中漂洗5 min后，流水下沖滴20 min，再用純水沖洗3～4遍后，置于超凈工作臺內備用。

1.3.2? ? 接種。在超凈工作臺內，用75%酒精浸沒莢果30 s，無菌水沖洗1～2遍，再用5%次氯酸鈉分別浸泡處理消毒，而后用無菌水沖洗3～4遍，取已滅菌的培養皿，用無菌濾紙吸干莢果表面水分，用手術刀縱向剖開莢果外皮。由于種子成熟度較低，種子難以均勻抖落在培養基上，要用手術刀和鑷子配合將種子從莢果內壁刮夾出來，再均勻接入培養基中。分別標注各組培養基以便后期觀察記錄和分析。

1.3.3? ? 培養及觀察。接種后的培養物放置在溫度為（23±2）℃培養室的培養架上暗培養10～20 d[5]，待種子長出絮狀組織后，逐漸轉入光強為500～1 000 lx的正常光照下培養，光照時間為8～10 h/d，各組不同成分構成的培養基區分放置，每隔10 d觀察并記錄種子萌發情況和污染情況。

1.3.4? ? 原球莖誘導增殖培養。接種60 d時大晶帽石斛種子萌發生長出原球莖，原球莖植株茂密嫩綠，可轉接到新的培養基中進行增殖培養。試驗中每團原球莖切割成較小的簇狀，而后接入MS+蛋白胨2.0 g/L+NAA 0.5 mg/L+花寶1號2.0 g/L+0.1%活性炭+0.58%瓊脂+2%蔗糖的培養基中，每個原球莖處理6瓶，培養40 d觀察長勢。

1.4? ? 測定方法與指標

接種后需定期觀察每個處理，分別記錄大晶帽石斛種子的萌發情況和污染情況。根據定期記錄的情況，統計種子萌發率，以種子生長出明顯的絮狀組織作為種子萌發的標志。相關計算公式如下：

萌發率/%=每組萌發種子粒數/每組接種種子粒數×100;

污染率/%=每組污染種子粒數/每組接種種子粒數×100。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 不同成分構成培養基對大晶帽石斛無菌萌發的影響

由表1可知，4種不同成分構成的培養基都可以讓大晶帽石斛種子在無菌條件下萌發，而且各處理之間差異明顯。NAA、花寶1號和蛋白胨對大晶帽石斛種子在無菌條件下萌發均有明顯影響。

2.1.1? ? NAA對大晶帽石斛種子無菌萌發的影響。由表1可知，添加了NAA的處理A、處理B培養基中大晶帽石斛種子的萌發率分別達到88%、72%，而沒有添加NAA的處理 C、處理D的萌發率僅為28%、20%。接種20 d時4個處理種子均有不同程度萌發，而40～60 d，處理C完全停止生長并死亡，處理D生長緩慢。由此可見，NAA可以顯著提高大晶帽石斛種子在無菌條件下的萌發率，生長期可以提供種子生長所需物質，但過高濃度的NAA在短時間內若不及時轉接，則不利于增殖誘導。

2.1.2? ? 花寶1號對大晶帽石斛種子無菌萌發的影響。一般來說，花寶1號成分主要有N、P、K，為大晶帽石斛種子無菌萌發過程中提供萌發所需物質。試驗結果表明，加入花寶1號的處理A、處理B、處理C中種子在20 d的萌發率較處理D高，而未加入花寶1號處理D的大晶帽石斛萌發率最低，僅為16%。60 d時處理D與處理C相比，種子褐化程度較高。由此可見，花寶1號有促進大晶帽石斛種子無菌萌發的作用，并且可以抑制種子褐化現象產生。

2.1.3? ? 蛋白胨對大晶帽石斛種子無菌萌發的影響。蛋白胨作為培養基的重要組成成分，主要提供給植物生長所需的有機碳源和氮源。當試驗進行60 d時，缺少蛋白胨的處理B和處理C的種子生長不及處理A旺盛，但早期萌發時處理A種子萌發率與其他組區別不明顯。由此可見，蛋白胨對大晶帽石斛種子無菌萌發影響較小，但具有為其生長提供養分的作用。

2.2? ? 不同消毒時間對大晶帽石斛無菌萌發的影響

大晶帽石斛種子從接種到萌發所需時間為20 d左右，但是不同消毒時間處理的種子所需時間不一致。由表2可知，相同成熟度的種子進行不同消毒時間的處理，萌發率會出現顯著差異。不同消毒時間處理對大晶帽石斛種子無菌萌發具有較明顯的影響，這與俞婷婷等[1]研究結果相符。當次氯酸鈉消毒時間最長為15 min時，污染率最低，為12%，萌發率最高，為88%，消毒效果最好;當消毒時間為12 min時，污染率升高為24%，萌發率降低為72%，消毒效果降低;當消毒時間為10 min時，污染率達60%，萌發率降低為28%，消毒效果不足;當消毒時間為8 min時，污染率最高，達80%，萌發率僅為20%。綜上可知，大晶帽石斛種子最佳消毒時間在15 min內，隨著消毒時間增加，消毒效果逐漸加強，由于大晶帽石斛莢果皮較厚，在沒有破壞莢果皮的情況下，種子活性不會被影響。當大晶帽石斛莢果的消毒時間為15 min 時，可以有效降低大晶帽石斛種子接種后的污染率。

3? ? 結論與討論

3.1? ? 外植體的選擇

由于大晶帽石斛種子非常微小，胚多半不成熟或發育不全，無胚乳[6]。本試驗中所使用外植體材料為成熟度70%原生大晶帽石斛莢果，莢果中種子由于成熟度不高，種子成塊粘連，不能自然抖落呈粉末狀，使得接種時種子必須成團接入培養基中，但當經過在適宜的誘導萌發培養基中培養20 d時，可以形成大量綠色原球莖。因此，大晶帽石斛種子無菌萌發時，可以選擇成熟度在70%左右、顆粒飽滿、無病蟲害、色澤均勻的健康莢果作為外植體。

3.2? ? 培養基成分構成

培養基成分構成的選擇對種子的無菌萌發至關重要，構成和各成分用量不同的培養基對種子的無菌萌發影響各不相同[7-9]。汪紅梅等[10]進行鐵皮石斛種子無菌萌發試驗時，使用MS改良培養基為基本培養基，添加2.0%土豆煮熟汁液、2.0%蔗糖、0.65%瓊脂和0.1 mg/L NAA作為種子萌發培養基，培養基滅菌前pH值為5.7，種子能正常萌發，且萌發率達90%以上。姚志軍等[11]進行齒瓣石斛種子無菌萌發試驗時，選用花寶1號（N∶P∶K為7∶6∶19）3 g/L+LH（水解乳蛋白）1 g/L+蔗糖25 g/L，培養基pH值為5.8～6.2，能在40～45 d獲得大量直徑1 mm左右的原球莖。本試驗中4個處理培養基種子均有萌發，但MS+花寶1號3 g/L+0.1%活性炭+0.58%瓊脂+2%蔗糖培養基和MS+蛋白胨 3 g/L+0.1%活性炭+0.58%瓊脂+2%蔗糖培養基中的種子在萌發絮狀組織后迅速死亡，或者生長較緩慢。由此可知，過量添加蛋白胨和花寶1號不利于原球莖的誘導，即可說明這2種培養基均不適宜用作大晶帽石斛的無菌萌發。MS+花寶1號2 g/L+NAA 1 mg/L+0.1%活性炭+0.58%瓊脂+2%蔗糖培養基能夠順利長出原球莖，當培養時間達60 d時，原球莖全部老化死亡，說明該培養基不適宜用于大晶帽石斛的無菌萌發。MS+蛋白胨2 g/L+NAA 0.5 mg/L+花寶1號2 g/L+0.1%活性炭+0.58%瓊脂+2%蔗糖培養基中種子萌發率最高，全部生長出綠色原球莖，并且植株健康、色澤均勻，說明該培養基配置適合大晶帽石斛的無菌萌發[12]，適量的蛋白胨與花寶1號配合使用可以誘導原球莖增殖。

3.3? ? 消毒時間選擇

大晶帽石斛種子無菌萌發率受消毒時間的影響較大。在種子無菌萌發試驗中消毒時間的選擇要衡量滅菌徹底和保持種子生物活性。消毒時間過短，滅菌不徹底，種子的污染率極高;消毒時間過長，種子活性被破壞，導致種子死亡，萌發率低[13]。本試驗表明，大晶帽石斛莢果在消毒15 min內污染率隨消毒時間的增加而降低，死亡率無明顯變化。可能是因為大晶帽石斛的莢果皮較厚，對莢果內種子保護較好，所以消毒時間為15 min未影響種子活性。綜上所述，大晶帽石斛種子無菌萌發對成熟且未開裂的莢果進行15 min消毒比較適宜。

3.4? ? 原球莖增殖

當大晶帽石斛經過25 d原球莖增殖增養后需要進行轉接擴大繁殖。本試驗在轉接10 d后，原球莖沒有出現增殖或死亡現象，說明培養基基本配比可以讓原球莖繼續生長，但生長速度較慢，可能是原球莖沒有適應新生長環境，或是切割傷口的恢復所需時間較長。莫昭展等[14]在進行鐵皮石斛原球莖的增殖研究表明，原球莖轉接10 d后開始增殖，40 d時增殖速度達到最高，所得結論與本試驗結果相符合。韓曉紅等[15]的金線蓮原球莖增殖試驗表明，不同的基本培養基對原球莖增殖效率影響顯著，其中B5培養基、MS培養基的增殖效率相對較高。本試驗中添加0.1 mg/L NAA也能促進原球莖的增殖，但是效果不明顯，增殖效率低。

3.5? ? 活性炭影響

王平紅[7]認為，在培養基中加入適量的活性炭，可以吸附具有抑制作用的化合物和植物激素。當植物生長素的含量大于細胞分裂素時，有利于種子萌發生根，還可以防止植物組織褐化、老化。有學者在進行安祖花人工種子的制備中添加了0.1%活性炭，不僅能夠提高種子在無菌環境下的萌發率，還能有效抑制黃化和褐化。李樹麗[9]認為活性炭用量超過2%會抑制生根。因此，本試驗中所有培養基均添加0.1%活性炭，以促進種子萌發，防止褐化。

本試驗通過比較不同培養基構成、不同添加物用量、不同消毒時間對大晶帽石斛種子無菌萌發的影響，旨在探究適合大晶帽石斛種子無菌萌發的條件，結果表明，在培養基中添加適量的NAA、花寶1號、活性炭和蛋白胨均對提高種子萌發率有幫助[16]。另外，用5%次氯酸鈉對大晶帽石斛莢果消毒15 min，可以有效抑制接種后培養基的污染。然而，本試驗內容還不夠全面，一些有助于植物組織生根的營養物質可以在以后的試驗中加入。試驗中還發現一些問題，即添加NAA 0.5 mg/L+花寶1號2.0 g/L+蛋白胨2.0 g/L培養基中愈傷組織較多，影響生長和觀察，原因可能是蛋白胨導致培養基中氮源過多，愈傷組織生長過旺;添加NAA 1.0 mg/L+花寶1號2.0 g/L培養基中種子會形成原球莖，之后原球莖迅速衰老死亡，其原因可能是NAA含量過高，NAA能促進細胞的分裂，添加1 mg/L NAA之后種子萌發迅速，但尚未及時轉移到新培養基中，原球莖便會快速衰亡，因而應該掌握適宜時期，在長出原球莖后盡快轉移進行增殖栽培，實現大晶帽石斛人工繁育產業化生產[17]。本試驗在前人研究的基礎上，進一步對大晶帽石斛種子的無菌萌發再生體系進行了研究，所得結論可以為大晶帽石斛的規模化生產提供一定的數據支持及參考。

4? ? 參考文獻

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