轉染人附睪蛋白4基因對人卵巢癌細胞基因表達的影響

朱連成，郭騫，勾睿，劉娟娟，劉晴，林蓓

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

卵巢癌作為女性生殖系統常見的惡性腫瘤，其死亡率居女性惡性腫瘤之首，大部分患者發現時已經是晚期［1］，其原因包括早期轉移、早期診斷困難及化療耐藥等［2］。人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4），又名乳清酸性蛋白4-二硫鍵核心結構域2（WAP four-disulfide core domain protein 2，WFDC2），是通過基因組及蛋白質組學篩選獲得的卵巢癌腫瘤標志物，2008年被美國FDA指定為監測上皮性卵巢癌復發的血清標志物，其敏感性、特異性較高，近年來引起研究者廣泛關注［3-5］，然而大部分研究集中于早期診斷、判斷預后等臨床方面，關于其對卵巢癌惡性生物學行為影響的機制研究較少［6-9］。因此，本研究采用了基因芯片技術對轉染了HE4基因的卵巢癌細胞系及其對應的空質粒轉染組細胞進行基因表達序列分析，找到差異表達基因并對其進行基因和蛋白水平的驗證，本研究采用基因本體（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，初步探討與HE4相關的分子機制，以期為卵巢癌中HE4相關的機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養、質粒構建及HE4基因轉染

人類上皮性卵巢癌細胞系ES-2購自美國ATCC，培養于含10%胎牛血清和1%盤尼西林/鏈霉素的RPMI-1640培養基，37℃恒溫，5% CO2加濕。全長人類HE4cDNA擴增 pEGFP-N1或者pCMV6質粒，引物如下：P1，5'-TCCGCTCGAGATGCCTGCTTGTCGCCT AG-3'；P2，5'-ATGGGGTACCGTGAAATTGGGAGTG ACACAGG-3'。轉染采用脂質體轉染試劑盒。細胞系分別標記為HE4高表達（HE4-H，O）和其對照空質粒轉染細胞（HE4-H-Mock，OV），見表1。

1.2 實時PCR驗證

TRIzol法分別提取各組細胞總RNA，SuperScriptⅢ反轉錄成cDNA。使用Roche LightCycler480進行實時PCR反應。HE4引物及內參GAPDH引物見表2。按照試劑說明和儀器操作規程將樣品總RNA逆轉錄為cDNA，于Roche LightCycler 480進行實時PCR反應，利用儀器所匹配的軟件計算每個基因的Ct值，常規采用ΔΔCt方法比較各自基因的表達量變化，并與基因芯片結果進行對比。反應至少進行3次。

表1 細胞系樣本及RNA質量評定Tab.1 Cell line samples and RNA quality evaluation

1.3 總RNA提取及質控

每組細胞系采用2個樣品進行準備，使用RNeasy Mini kit試劑盒提取總RNA，并以RNeasy MinElute Cleanup columns進一步純化。使用NanoDrop DN-1000對RNA質量及純度進行評估，A260/A280≥1.8且A260/A230≥1.5作為標準?？俁NA質量采用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測。2組標本的RNA標記及檢測數值見表1。

1.4 基因芯片雜交、數據收集

本研究中，每組標本采用3張芯片進行分析以充分降低誤差。樣品使用Phalanx雜交系統試劑盒進行擴增和標記，采用 Human Whole Genome OneArray?（HOA6.1）芯片進行雜交。該芯片有30 275個DNA寡核苷酸探針，其中29 187個在RefSeq v38和Ensembl v56數據庫中索引，含有1 088個質控探針。反應過程如下：50 ℃雜交16 h，3步法洗脫非特異性結合（步驟1，42 ℃洗脫 5 min 1次；步驟2，42 ℃洗脫5 min 1次，25 ℃洗脫5 min；步驟3，沖洗20次），芯片離心后烘干并使用Axon4000B對芯片的信號強度數據進行掃描提取。

1.5 實時PCR驗證芯片結果

為了后續研究的持續性，在差異表達基因中挑選了上調的2個基因（FOXA2和SERPIND1），在2組細胞系中進行實時PCR分析，從而在RNA水平驗證芯片結果。以GAPDH作為內參，引物由Invitrogen公司合成，方法同上。引物序列及產物見表2。

1.6 免疫組化驗證芯片結果

選取經過實時PCR驗證過的基因SERPIND1，同HE4一起，進行免疫組化驗證其在卵巢癌組織中的表達。標本來源于2004年到2012年由中國醫科大學附屬盛京醫院婦科收集的50例卵巢癌組織。按照常規SP方法對所有石蠟切片進行HE4及SERPIND1免疫組化染色，二者的一抗濃度為分別為1 ∶100和1 ∶400，肝癌組織作為陽性對照，結果判定標準為定位于胞質或胞膜中的棕黃色顆粒為陽性染色。在400倍光學顯微鏡下選擇具有代表性的5個高倍鏡視野，評分標準如下：染色程度0 分，基本不著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。著色細胞占計數細胞的百分率：0分，0%～5%；1分，＞5%～25%；2分，＞25%～50%；3分，＞50%～75%；4分，＞75%～100%。最后得分為兩者的乘積：0～2分標記為-，3～4分標記為+，5～8分標記為++，9～12分標記為+++。-及+判定為低表達，++及+++判定為高表達。2位獨立閱片者分別對標本進行評判。

表2 實時PCR反應中各基因所用引物序列及產物大小Tab.2 Gene-specific primers used in real time-PCR and their products

1.7 統計學分析

采用GenePix4.1軟件對基因芯片采集的所有數據進行分析，篩選差異表達基因的條件是log2∣倍數變化∣≥1.5同時P＜ 0.05。對差異表達基因進行GO及KEGG信號通路等富集分析。應用 SPSS 20.0進行獨立樣本t檢驗和χ2檢驗，相關性分析采用Spearman方法，應用GraphPad Prism進行制圖。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染細胞驗證及總RNA質量檢驗結果

分別對3組細胞進行HE4的mRNA表達含量測定，發現HE4在HE4轉染組細胞中的表達明顯高于空質粒轉染組細胞（2.403±0.473 vs 1.128±0.102，P＜ 0.001）及原始未處理組細胞（2.403±0.473 vs 1.112±0.099，P＜ 0.001），而后2組細胞的HE4表達水平差異無統計學意義（P=0.909）。將HE4轉染組及空質粒轉染組標本的RNA進行質量檢測，發現2組的A260/A280比率為2.02，A260/A230比值為2.21～2.35（表1），瓊脂糖凝膠電泳檢測可見RNA條帶清晰，無向低分子量區域的成片拖帶現象，說明2組樣品總RNA完整，無降解（圖1），樣品RNA的質量滿足基因芯片雜交檢驗的質控要求。

2.2 芯片雜交結果

圖1 轉染細胞的總RNA凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis for total RNA of ovarian cancer cells

對所有采集的信號統一歸一化log10計算，而后進行散點圖分析以評估實驗芯片的變異性，同時進行火山圖分析以顯示差異表達基因。結果顯示，樣品總體的數據變異性較?。▓D2A），倍數變化存在顯著的差異性，可挑選出差異表達基因（圖2B），其中356個基因表達下調，283個基因表達上調，數據可靠。按照倍數變化由高到低排序，列出2組10個代表性差異表達基因，見表3。

2.3 GO富集分析

GO 富集分析結果顯示，差異表達的基因在分子功能上，參與到了酶、轉錄因子及DNA結合；在細胞成分上，參與到了細胞核、胞質及胞外域作用；在生物過程上，參與到了生物高聚物代謝、程序性細胞死亡及凋亡等。見表4。

2.4 信號通路分析

對差異表達基因進行KEGG通路分析，發現MAPK、性激素生物合成、癌癥、細胞周期、p53信號等通路顯著富集，見表5。

圖2 數據歸一化處理后的散點圖及火山圖Fig.2 Scatter plot and volcano plot after normalization

2.5 實時PCR及免疫組織化學方法驗證芯片結果

在差異表達基因中挑選2個表達上調的基因（FOXA2、SERPIND1）進行了實時PCR實驗以驗證芯片結果的可靠性，結果顯示，基因FOXA2的mRNA相對表達在HE4轉染組細胞中為4.712±1.504，明顯高于空質粒轉染組（1.177±0.264，P=0.002）及原始未處理組（1.238±0.394，P=0.002）的表達量，而后兩組的表達量差異無統計學意義（P=0.757）；基因SERPIND1的mRNA相對表達在HE4轉染組細胞中為1.703±0.487，明顯高于空質粒轉染組（0.956±0.246，P=0.006）及原始未處理組（0.959±0.080，P=0.006）的表達量，而后兩組的表達量差異無統計學意義（P=0.977）。實時PCR的結果與基因芯片顯示的結果相一致。將經過實時PCR驗證的SERPIND1通過免疫組化方法進行蛋白水平的驗證。結果顯示，類似于HE4，SERPIND1在細胞中的表達以胞質及胞膜中為主（圖3），HE4及SERPIND1在卵巢癌組織中的陽性表達率分別為78%及88%，高表達率分別為66%及62%。進一步分析發現，在50例標本中，HE4及SERPIND1同時陰性的有4例，同時陽性的有37例，Spearman相關性分析提示兩者表達呈正相關（r=0.402，P=0.003）。以上通過基因及蛋白水平，驗證了基因芯片結果的可靠性。見表6。

表3 差異表達基因列表（上調及下調基因各列出10個代表性基因）Tab.3 Gene list of differentially expressed genes（selective 10 up and down genes）

表4 各組差異表達基因GO富集分析Tab.4 GO enrichment analysis with differentially expressed genes

表5 差異表達基因參與的信號通路Tab.5 Results of the KEGG pathway analysis for differentially expressed genes

圖3 免疫組化檢查驗證基因芯片結果Fig.3 Immunohistochemical staining for validation of differentially expressed genes

表6 HE4及SERPIND1在卵巢癌組織中表達的相關性分析Tab.6 The relevance analysis of HE4 and SERPIND1 expression in ovarian cancer

3 討論

卵巢癌的發病率居于婦科惡性腫瘤第三位，每年可導致全球范圍內15萬患者死亡［1］。因此，找到能夠早期診斷、監測預后的指標，對于提高卵巢癌患者的生存率有著重要作用。HE4在卵巢癌的早期診斷、預后評估等諸多方面引起大家的廣泛關注［10-11］，但關于它的基礎研究甚少。本研究通過基因芯片分析了轉染HE4基因后卵巢癌細胞基因表達的變化，這些差異基因的已知功能，可為卵巢癌中HE4的研究提供新思路。

SERPIND1基因也被稱為肝素輔因子Ⅱ（heparin co-factorⅡ），屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpin）超家族成員［12］，近年來發現許多Serpin家族的成員與腫瘤的發展有關，比如SERPINI2、SERPINB5、SERPINA9分別參與到了乳腺癌、前列腺癌和B細胞淋巴瘤等腫瘤的轉移發展中［13-14］。SERPIND1的相互作用蛋白FGA、FGB、FGG與肺癌的上皮間質轉化過程可能存在相關性，而其上游調控因子也可能參與卵巢癌的上皮間質轉化［15］。在非小細胞肺癌中，SERPIND1可以通過PI3K途徑促進肺癌細胞生成偽足，增強侵襲和遷移能力，它的過表達與更易復發及更短的生存時間相關［16］。本研究發現SERPIND1的基因及蛋白表達水平在卵巢癌中增高，且和HE4表達呈正相關，對該基因的進一步研究，有望為卵巢癌的發生發展機制、診斷標記物的研發等提供理論依據。

HE4可以促進卵巢癌細胞侵襲、轉移、耐藥［6，17-18］，但相關的作用機制仍存在爭議。有研究［9］發現HE4可通過激活EGFR-MAPK信號通路促進卵巢癌細胞的黏附、遷徙和腫瘤生長，而其他研究者發現HE4通過抑制細胞增殖而在卵巢癌進展中起到保護性作用，推測該行為可能是通過激活MAPK和PI3K/Akt途徑產生［19］；HE4可與膜聯蛋白A2形成復合體，通過MAPK和FOCAL信號通路促進腫瘤惡性進展［5，7］；HE4可以與EGFR，IGF1R和轉錄因子HIF1α相互作用，促進卵巢癌細胞的侵襲、耐藥［17］；HE4可激活AKT和Erk途徑誘導卵巢癌細胞的耐藥［4］。本研究找到了和HE4表達相關的通路，包括MAPK、性激素生物合成、細胞周期、p53等，首次在基因水平上為HE4相關的基礎研究提供了切實可靠的參考。

綜上，本研究通過基因芯片分析了轉染HE4基因后卵巢癌細胞基因表達的變化，鑒別出了差異表達基因，其中，上調283個，下調356，并對結果進行基因及蛋白水平的驗證，GO富集分析發現差異基因在生物過程中，參與到了生物高聚物代謝、程序性細胞死亡及凋亡等，KEGG通路分析發現差異基因參與到了MAPK、性激素生物合成、癌癥、細胞周期、p53信號等。這些結果為卵巢癌中HE4的功能、機制和相互作用等基礎研究提供了新的理念及參考。