過表達ATG4A對晶狀體上皮細胞上皮-間質轉化的影響

閆楚凡，王靜，2，張勁松，2

（1.中國醫科大學附屬第四醫院眼科，遼寧省晶狀體學重點實驗室，沈陽 110005；2.沈陽愛爾卓越眼科醫院白內障中心，沈陽 110001）

晶狀體是位于玻璃體前的透明無血管組織，光線經其折射后在視網膜上形成清晰圖像，因此晶狀體透明度的維持對視力十分重要。晶狀體包含晶狀體上皮細胞和由其分化而來的纖維細胞2種細胞。在晶狀體的赤道部上皮細胞中的細胞器逐漸退化，分化成纖維細胞并將其向晶狀體核壓縮，這個過程稱為上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）。隨著年齡的增長，晶狀體的體積和質量都在不斷增大［1］，由于氧化應激、紫外線照射等原因導致EMT過程發生障礙，可以導致晶狀體渾濁并形成白內障，嚴重影響視力。

自噬是細胞內重要的分解代謝過程，是細胞質內的蛋白大分子和細胞器（線粒體、內質網等）被雙層膜結構的自噬泡包裹并運送到溶酶體進行溶解消化的過程［2］。自噬通常分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。其中巨自噬研究最廣泛，本研究自噬為巨自噬。自噬可以影響多種生物學過程（增殖、凋亡等），GUGNONI等［3］認為自噬與EMT之間存在著復雜的相互作用關系，二者水平的提高可以幫助腫瘤細胞在極端條件下存活，而在這個過程中，細胞骨架和線粒體作為調控的功能中心起到了重要作用。但二者之間具體的相互作用機制目前尚不清楚。

目前已經報道30多種自噬相關基因，其中自噬相關基因4A（autophagy-related gene 4A，ATG4A）是一種半胱氨酸蛋白酶，可以在C-末端切割ATG8，暴露出的甘氨酸能夠與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）結合形成ATG8-PE系統，該系統在自噬泡的形成過程中起到了重要的作用［4-5］，但是該基因在EMT方面的作用尚不清楚。本研究通過細胞實驗，探索ATG4A在晶狀體上皮細胞EMT中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試劑和儀器

人晶狀體上皮細胞HLE B3細胞株，購自美國ATCC公司，經細胞系短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）鑒定。ATG4A慢病毒質粒購于加拿大ABM公司。試劑和儀器包括DMSO（美國SIGMA公司），MEM培養液、雙抗、胰蛋白酶、PBS（中國凱基公司），胎牛血清（FBS，澳洲AusGeneX公司），RNA iso Plus，cDNA反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），Trixon X-100（中國Solarbio公司），4%多聚甲醛（中國博士德公司），SDS-PAGE膠（中國碧云天公司），PCR逆轉錄儀（美國BIO-RAD公司），mRNA引物（中國 Genecreate 公司），RT-PCR儀（美國Applied Biosystem公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：將HLE B3 細胞凍存管從-80 ℃冰箱中取出，迅速放入37 ℃水浴鍋中搖晃至融化，將其放入離心機中1 000 r/min離心3 min，棄掉上清并加入1 mL完全培養基，吹打至單細胞懸液后移至中皿（直徑=6 cm）中，另加入4 mL完全培養基并吹打均勻。棄去舊培養基，PBS沖洗2次并加入新完全培養基（中皿）繼續培養。待細胞長至密度為80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶液消化，收集細胞后加入新鮮完全培養基鋪皿并吹打均勻，按1 ∶3比例傳代培養。細胞凍存液（完全培養基∶FBS ∶DMSO=7 ∶2 ∶1）凍存細胞。正常完全培養基培養細胞為對照組，H2O2濃度200 μmol/L培養細胞為實驗組。

1.2.2 ATG4A慢病毒質粒轉染：引物序列包括CMV，5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'；SV40，5'-TAGTCAGCCATGGGGCGGAGA-3'，將細胞傳代至6孔板中，取對數生長期HLE B3細胞待其密度至50%時換無血清無雙抗培養基培養24 h，棄掉培養基，加入在室溫下靜置了20 min的轉染混合液（4 μg質粒DNA，10 μL LipoGeneTM2000 Star 轉染液和0.5 mL Opti-MEM），另加入2 mL Opti-MEM并在培養箱中培育6 h，棄轉染混合液并換完全培養基培養48 h后進行下一步實驗。轉染ATG4A質粒的人晶狀體上皮細胞為過表達ATG4A組（OE-ATG4A組），轉染空載體的人晶狀體上皮細胞為陰性對照組（NC組）。

1.2.3 實時qPCR檢測各組細胞中EMT：分別提取經H2O2處理24 h后正常培養的細胞以及轉染36 h后的細胞的總RNA，并用反轉錄試劑盒將得到的RNA反轉錄為cDNA，利用實時PCR試劑盒進行實時qPCR反應，操作步驟遵循說明書。所用引物序列如下：ATG4A，上游引物5'-AATGGCACAAATGGGTGTAGG-3'，下游引物5'-CCAAGGAATTCCATTCGTCAA-3'；VIM，上游引物5'-AGAGAGGAAGCCGAAAACACC-3'，下游引物5'-GATTCCACTTTGCGTTCAAGG-3'；E-cadherin，上游引物5'-TGCTGTTTCTTCGGAGGAGAG-3'，下游引物5'-GCAGCTGGCTCAAGTCAAAGT-3'。

1.2.4 Western blotting檢測各組細胞中EMT：細胞轉染48 h后，利用蛋白快速提取試劑盒提取總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。利用SDS-PAGE膠分離蛋白，并通過濕轉膜方式將蛋白質轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用ATG4A（1 ∶1 000），VIM（1 ∶2 000），E-cadherin（1 ∶5 000）4 ℃搖床上過夜孵育，GAPDH（1 ∶10 000）作為內參對照，將孵育過一抗的PVDF膜用山羊抗兔二抗（1 ∶2 000）室溫下搖床上孵育2 h，使用化學發光檢測液進行顯影。

1.2.5 DCFH-DA活性氧熒光探針檢測各組HLE B3細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平：HLE B3細胞提前傳代至6孔板中，并轉染ATG4A質粒和空載體。胰蛋白酶消化細胞至15 mL離心管中，用10 μmol/L DCFH-DA標記細胞于37 ℃中20 min，每隔3～5 min顛倒混勻。用無血清培養基洗滌細胞3次后，用流式細胞儀分析2組細胞中ROS水平。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，本研究中測量指標的計量資料經K-S檢驗呈正態分布，以表示；2組比較采用獨立樣本t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2模型中晶狀體上皮細胞的EMT水平

使用實時qPCR和Western blotting方法分別從mRNA和蛋白水平檢測H2O2對EMT水平的影響，結果發現，與對照組比較，在mRNA水平波形蛋白（vimentin，VIM）表達量上升，E-鈣黏蛋白表達量下降，差異有統計學意義（P＜ 0.05），說明EMT水平明顯加強。但蛋白水平表達均無明顯變化，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表1、圖1。

2.2 過表達ATG4A的晶狀體上皮細胞中EMT水平

表1 H2O2與ATG4A對HLE B3細胞EMT水平的影響Tab.1 Effects of H2O2 and ATG4A on EMT in HLE B3 cells

圖1 Western blotting檢測H2O2與ATG4A對HLE B3細胞EMT水平的影響Fig.1 Western blotting analysis for evaluating the effects of H2O2 and ATG4A on EMT in HLE B3 cells

結果顯示，在mRNA和蛋白水平，與NC組比較，OE-ATG4A組中VIM的表達量均升高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），而E-鈣黏蛋白表達水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），見表1、圖1。說明ATG4A能夠促進EMT。

2.3 ATG4A過表達對晶狀體上皮細胞中ROS水平的影響

結果顯示，與NC組（230.930±6.746）比較，OEATG4A組（233.190±7.099）晶狀體上皮細胞內平均熒光強度并沒有顯著增強，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。本實驗中沒有發現過表達ATG4A能夠促進晶狀體上皮細胞中ROS的水平，該表型還需要進一步驗證。

圖2 ATG4A對HLE B3細胞中ROS水平的影響Fig.2 The effect of ATG4A on ROS level in HLE B3 cells

3 討論

白內障是世界范圍內致盲的首要原因［6］，它的形成受多種條件因素（紫外線、氧化應激、激素不良反應等）影響。這些影響因素通過促進或者抑制相關基因表達，使晶狀體上皮細胞增殖、凋亡、EMT異常，進而導致白內障的發生。用H2O2處理晶狀體上皮細胞，構建的年齡相關性白內障模型被廣泛應用于晶狀體的發生發展與白內障形成的研究中［7］。

晶狀體中有多種酶存在，具有緩解或阻止蛋白質等大分子異常聚集，維持晶狀體透明性作用［8］，而ATG4A是自噬基因中唯一的蛋白酶［9］。本研究結果顯示，在mRNA和蛋白水平均發現H2O2處理的人晶狀體上皮細胞中ATG4A表達量顯著升高，說明ATG4A能夠影響晶狀體上皮細胞的發育。

目前關于ATG4A的研究主要集中于其對腫瘤發生發展的影響。YANG等［10］研究表明ATG4A在胃腸道腫瘤細胞中高表達，能夠促進胃腸道腫瘤細胞的侵襲、遷移以及代謝。WOLF等［11］發現ATG4A能夠維持乳腺癌細胞的干細胞特性。ATG4A在肺癌［12］、子宮頸癌［13］中的作用也陸續被發現，但在晶狀體發生發展與白內障形成中的作用尚不清楚。本研究發現，在過表達ATG4A的人晶狀體上皮細胞中，EMT水平明顯升高，證明ATG4A對該表型有促進作用。

自噬與EMT的關系在眼科疾病中的研究較少，目前只集中于視網膜疾病，且多是細胞層面的實驗。FENG等［14］在視網膜上皮細胞中構建EMT模型，發現自噬水平顯著升高，而在該種細胞中通過敲除ATG7構建自噬缺陷模型后，發現視網膜上皮細胞失去了上皮細胞表型，說明自噬能夠有效抑制視網膜上皮細胞中的EMT并加強細胞間連接。BAEK等［15］發現在視網膜上皮細胞中，KRT8和自噬水平升高能夠抑制氧化應激引起的EMT，并阻止細胞死亡。WU等［16］發現在TGF-β誘導的視網膜上皮細胞EMT模型中，自噬的水平顯著升高，而雷帕霉素誘導的自噬水平升高能進一步加強視網膜上皮細胞中的EMT水平。此結論與FENG等［14］的結論相反，說明自噬與EMT之間的相互作用關系十分復雜，即使在同一種細胞系中，不同的影響條件也會得出不同的結論。

疾病的發生不是單一的生物學過程，自噬和EMT水平的異常都能導致晶狀體發育異常和白內障的形成，因此將二者結合研究對于維持晶狀體上皮細胞的正常生長和分化是十分有意義的。本實驗首次在人晶狀體上皮細胞中將自噬相關基因與EMT水平聯系起來，為研究白內障的形成提供了新的方向。

以往研究［17-18］認為ATG4A基因具有ROS依賴性，細胞內ROS的水平可以極大影響ATG4A的表達，然而本研究發現過表達ATG4A的人晶狀體上皮細胞中，ROS水平與NC組相比差異無統計學意義（P＞0.05），說明ATG4A無法直接影響正常生長的晶狀體上皮細胞中ROS的水平，但是ATG4A在病理條件下能否影響ROS的水平還需進一步探索。

綜上所述，ATG4A對于晶狀體上皮細胞的EMT水平具有促進作用，但無法直接影響細胞內的ROS水平。本研究利用細胞轉染的方法構建ATG4A過表達的人晶狀體上皮細胞模型，探索了ATG4A對人晶狀體上皮細胞表型的影響，初步論證了ATG4A在晶狀體發育和白內障形成過程中的作用。