基于細胞焦亡理論研究白細胞介素-1β與白細胞介素-18在抗結核藥物性肝損傷中的臨床意義

李玉紅，郝明媛，焦連麗，王愛欣，任琦，馮福民

（1.華北理工大學公共衛生學院河北省煤礦衛生與安全重點實驗室，河北 唐山 063210；2.呼倫貝爾市傳染病醫院檢驗科，內蒙古 呼倫貝爾 162650）

標準短程化療仍是目前抗結核治療的最有效方法。抗結核藥物性肝損傷（anti-tuberculosis drug induced liver injury，ADLI）是化療期間最常見的不良反應，常導致治療間斷，嚴重者可致肝衰竭甚至死亡［1-2］。ADLI作用機制復雜，迄今尚未闡明。近來，研究者提出一個藥物性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）發病機制的重要假說，即炎癥和藥物暴露的相互作用［3］。

細胞焦亡（pyroptosis）學說是目前炎癥反應機制研究的新熱點。pyroptosis是一種促炎的程序性死亡方式，其主要依賴于炎性半胱天冬氨酸蛋白酶（cysteine-aspartic acid protease 1，Caspase-1）的活化，進而介導白細胞介素（interleukin，IL）-1 β 活化、IL-18 分泌，并誘發級聯放大的炎癥反應，最終誘導細胞炎性死亡［4］。研究［5］發現，在熱應激誘導大鼠肝損傷模型中，熱應激可刺激炎性體的激活，最終導致Caspase-1活化和IL-1β分泌，證明IL-1β參與了急性肝損傷過程。IL-1β和IL-18 炎性細胞因子的產生被認為是pyroptosis發生的重要指標，但目前缺乏ADLI患者中的IL-1β和IL-18水平的臨床研究。因此，本研究探討IL-1β與IL-18在ADLI 患者血清中的變化，以期為ADLI 早期抗炎干預治療提供臨床依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月至2017年1月于唐山市第四醫院接受標準短程化療的初治肺結核患者。肺結核的診斷標準依據《肺結核的診斷和治療指南》［6］，ADLI的診斷標準依據 《國際共識會議標準》［7］，即丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）＞2倍的正常值上限（upper limit of normal value，ULN），或天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和總膽紅素（total bilirubin，TBIL）聯合升高，且其中之一升高＞2×ULN。具有以下任何一項的患者不納入本研究：（1）基線肝功能異常者；（2）患有可引起肝功能異常的其他疾病者（如病毒性肝炎、自身免疫型肝炎、酒精性肝病、脂肪肝、菌血癥、充血性心力衰竭等）；（3）服用其他可引起肝功能異常的藥物者。符合ADLI 標準的患者為病例組，對每個ADLI病例，按照年齡、性別、治療史、藥物劑量和方案匹配的原則選擇1個非ADLI（non-ADLI）患者作為對照。本研究獲得華北理工大學倫理委員會批準，并經患者知情同意，所采集的標本僅用于醫學研究。

1.2 主要試劑和儀器

ELISA試劑盒購自艾美捷科技有限公司生產，全波長多功能酶標儀購自美國Thermo公司，HITACHI 7600-020全自動生化分析儀購自日本日立公司；Heraeus高速冷凍離心機購自德國Thermo公司。

1.3 血清標本的選擇

ADLI組為服用抗結核藥后，臨床檢測肝功能指標異常，且達到診斷ADLI標準的血清標本；非ADLI組為服用抗結核藥，與ADLI組用藥時間相匹配且未發生肝損傷的血清標本。

1.4 檢測方法

采集患者清晨空腹外周靜脈血5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心分層提取血清；全自動生化分析儀檢測肝功能情況；采用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）檢測IL-1β及IL-18 的水平。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，本研究中連續變量均不符合正態性分布，用M（P25～P75）表示，采用秩和檢驗Mann-WhitneyU試驗進行分析；分類變量用例數（構成比）表示，用χ2檢驗進行分析；應用Spearman等級相關分析評價變量之間的相關性；受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積（area under the curve，AUC）用來評估IL-1β的診斷價值，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

病例組共41例ADLI患者，其中，男31例，女10例，平均年齡31（24～51）歲，年齡范圍20～78歲；對照組共41例非肝損傷患者，其中，男31例，女10例，平均年齡33（24～51）歲，年齡范圍19～79歲。由于匹配設計的要求，2組性別和年齡的分布無統計學差異。體質量指數（body mass index，BMI）差異有統計學意義（P＜ 0.01），2組在文化程度、職業、吸煙、飲酒、居住環境因素方面差異無統計學意義（P＞ 0.05），見表1。

2.2 2組患者肝功能水平比較

血清中AST、ALT、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平在ADLI組和非ADLI組中差異有統計學意義（均P＜ 0.05），見表2。

2.3 2組患者血清IL-1β與IL-18 水平比較

血清IL-1β 在ADLI組和非ADLI組中差異有統計學意義（P＜ 0.01），血清IL-18在2組間比較無統計學差異，見表3。

2.4 2組患者血清IL-1β與肝功能指標的相關性分析

進一步對研究對象血清IL-1β水平與肝功能指標水平進行相關性分析，發現血清IL-1β與AST、ALT及ALP呈正相關（均P＜ 0.05），且與ALT、AST相關性更顯著（P＜ 0.01）。

2.5 血清IL-1β水平對ADLI患者的預測價值

血清IL-1β水平對ADLI預測價值以AUC方式評估，見圖1。血清IL-1β水平 的AUC是0.889（SE為0.037，95%CI：0.817～0.961），進一步根據ROC曲線獲得的各樣本的靈敏度和特異度，計算約登指數（Youden'S index=靈敏度+特異度-1），以最大值對應數據作為最佳篩查陽性界值（cut-off值），可知，cut-off值為58.55 pg/mL。

表1 ADLI組和非ADLI組一般資料的分布情況Tab.1 Distribution of general data for the ADLI and non-ADLI groups

表2 ADLI組和非ADLI組肝功能指標結果Tab.2 Results of liver function indicators in the ADLI and non-ADLI groups

表3 ADLI組和非ADLI組血清IL-1β與IL-18 表達水平Tab.3 Serum IL-1β and IL-18 expression levels in the ADLI and non-ADLI groups

3 討論

炎癥反應被認為是ADLI的關鍵發病機制，細胞凋亡作為程序性細胞死亡的主要形式，被證明在藥物誘發肝損傷的炎癥反應中起主要作用［8］。近來，程序性細胞死亡的另一種重要形式“pyroptosis”被報道也參與疾病的發生發展過程。IL-1β和IL-18是pyroptosis研究中起關鍵作用的促炎性細胞因子，可誘發級聯放大的炎癥反應，最終誘導細胞炎性死亡［9］。ADLI是否與IL-1β和IL-18有關尚未闡明。因此，本研究探討了IL-1β和IL-18與ADLI的關系。

表4 血清IL-1β 與肝功指標相關性分析Tab.4 Correlation analysis between serum IL-1β and liver function indicators

圖1 血清IL-1β 預測ADLI的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum IL-1β predicting ADLI

本研究中，ADLI組與非ADLI組相比，血清IL-1β水平升高，差異有統計學意義，血清IL-1β與ALT、AST存在相關性，且IL-1β水平診斷ADIL的AUC為0.889。由此可見，IL-1β會隨著ADLI 的發生而升高。IL-1β主要是由激活的單核巨噬細胞產生，但中性粒細胞、表皮細胞和內皮細胞在受到外界抗原刺激后也可合成與分泌IL-1β，其主要由Toll 樣受體/Nod樣受體通路以及Caspase-1 通路進行調節和激活，IL-1β是炎癥放大啟動因子，可促進炎性細胞的活化與聚集中性粒細胞［10］。關于pyroptosis與ADLI的研究雖未見報道，但已發現在膿毒癥誘導小鼠急性肝損傷時，Caspase-1表達升高，血清中IL-1β增加，升高的IL-1β加重肝細胞死亡［11］。苯并［a］芘誘導HL-7702人正常肝細胞損傷中，也發現Caspase-1及IL-1β水平升高［12］。IL-1β主要作為促炎性介質激活和募集白細胞，尤其是中性粒細胞進入組織［13］，可參與器官損傷過程［14］。在熱應激誘導肝損傷的研究中發現，抑制 IL-1β可降低肝臟中髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性并緩解肝損傷，表明IL-1β在觸發中性粒細胞組織浸潤和肝損傷中的重要作用。另外，用 IL-1β抑制劑處理的大鼠顯示出較低的血清ALT活性和肝臟組織學評分［5］。這些結果提示，在肝細胞受到損傷時伴隨著IL-1β的釋放，其在肝損傷中發病機制中起作用。本研究結果證明在ADLI過程中也伴隨IL-1β的升高，為ADLI中抗IL-1β干預的研究奠定了基礎。

IL-18也是T細胞介導肝損傷的媒介，在肝臟中不僅由庫普弗細胞表達，也可由損傷的肝細胞合成［15］。IL-18的分泌可加劇代謝紊亂及免疫功能損傷，此外，IL-18還能促進T淋巴細胞的增殖和分化，直接介導肝細胞的損傷［16］。非酒精性脂肪肝病患者與正常人比較，血清IL-18水平升高，提示IL-18可能是脂肪變性損害和肝臟炎癥中的一個重要發病因素［17］。然而，本研究中未觀察到升高的IL-18。這可能是因為IL-18不是與ADLI關系密切的指標，可能僅在血清中瞬時釋放，或在受影響的組織或炎癥部位局部表達。迄今為止，在全基因組及轉錄組研究中尚未出現指示體內IL-1β釋放的基因表達特征［18］。

總之，本研究表明血清IL-1β與ADLI有關聯，在ADLI診斷中具有潛在價值。下一步需研究IL-1β促成ADLI的發病機制，探索IL-1β在ADLI中靶向治療的可能性。