子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中血管緊張素受體的表達及其臨床意義

鐘文萱，李娟，戴姝艷

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

子宮內(nèi)膜異位癥是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）在子宮腔被覆內(nèi)膜及子宮以外的部位出現(xiàn)、生長、浸潤，反復出血，繼而引發(fā)疼痛、不孕及結節(jié)或包塊等。子宮內(nèi)膜異位癥是生育年齡婦女的多發(fā)病、常見病，其病變廣泛、形態(tài)多樣、極具侵襲性和復發(fā)性，具有性激素依賴的特點。子宮內(nèi)膜異位癥根據(jù)發(fā)生部位大致可分為腹膜型、卵巢型、深部浸潤型和其他部位型。腹壁子宮內(nèi)膜異位癥多繼發(fā)于剖宮產(chǎn)術后，發(fā)病率0.03%～0.4%［1］。腹壁子宮內(nèi)膜異位癥藥物治療效果不理想，目前傾向于手術治療，但極易復發(fā)，甚至惡變［2］。研究［3］表明血管生成是子宮內(nèi)膜異位種植和發(fā)展的主要機制之一。人體腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS）主要負責調(diào)控水、電解質(zhì)、體液平衡和血壓穩(wěn)定。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，ANGⅡ）是RAAS的核心，主要通過與血管緊張素1型受體（angiotensin type 1 receptor，AT1R）和血管緊張素2型受體（angiotensin type 2 receptor，AT2R）結合發(fā)揮作用，包括調(diào)節(jié)局部血流和血管緊張性，推動血管平滑肌代謝以及生長等，與新血管形成有關。AT1R主要負責升高血壓、調(diào)動部分血流乃至血管緊張性等；而AT2R用來補償AT1R帶來的血管效應［4-5］。動物實驗［6-7］已經(jīng)證明利用AT1R阻斷劑替米沙坦可以干預炎癥反應及血管生長，從而有效抑制小鼠異位內(nèi)膜病灶的生長。NAKAO等［8］在體實驗發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜中檢測出AT1R與AT2R的表達，同時還發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位囊腫中AT1R/AT2R比率顯著高于正常增殖期子宮內(nèi)膜。然而，至今為止針對腹壁子宮內(nèi)膜異位癥與血管生成因素的相關研究國內(nèi)外均未見報道，本研究通過免疫組化檢測腹壁異位子宮內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織AT1R與AT2R蛋白的表達，并探討其表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及分組

選取2016年5月至2018年6月我院行手術治療后的腹壁子宮內(nèi)膜異位癥患者（40例）的腹壁異位內(nèi)膜組織作為實驗組，患者年齡30～47歲，平均（36.06±4.85）歲，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）（20.91±4.64）kg/m2，孕 次（1.43 ±1.45）次，心率（74.32±14.64）次/min，收縮壓（114.7±20.9）mmHg，舒張壓（76.1±11.2）mmHg。選取同期本院由于子宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）且無生育要求而行全子宮切除手術40例患者的正常子宮內(nèi)膜組織作為對照組，患者年齡27～47歲，平均（38.94±6.38）歲，BMI（21.52±3.78）kg/m2，孕次（1.53±1.37）次，心率（75.64±15.32）次/min，收縮壓（118.2±18.5）mmHg，舒張壓（80.3±14.7）mmHg。2組年齡、BMI、孕次、心率、血壓比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞ 0.05）。入組標準：（1）月經(jīng)規(guī)律；（2）至少3個月內(nèi)無放置宮內(nèi)節(jié)育器病史或激素類藥物治療史；（3）無放射治療史及化療史；（4）不伴有子宮內(nèi)膜不典型增生；（5）無高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病以及惡性腫瘤等相關疾病；（6）選取的組織都已通過臨床和病理學檢查證實。

1.2 試劑

AT1R兔多克隆抗體（ab124505）及AT2R兔多克隆抗體（ab19134）購自英國Abcam公司，即用型SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 方法

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波抗原修復，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶于37 ℃溫箱中30 min，山羊血清37 ℃溫箱中40 min，AT1R（1 ∶300）、AT2R（1 ∶200）4 ℃過夜，加二抗于37 ℃溫箱中孵育30 min，辣根標記液于37 ℃溫箱中孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定

AT1R依照細胞膜以及細胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕色作為陽性結果，AT2R則以細胞核膜及細胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕色作為陽性結果［8］。結果判斷采用Formwitz 評分方法［9］，（1）a是陽性率評分：每一張切片在光鏡下任選5個高倍鏡視野（×400），觀察視野中全部細胞，計算陽性細胞的百分率并取平均值，陽性細胞＜5%，0分；陽性細胞5%～25%，1分；陽性細胞26%～50%，2分；陽性細胞51%～75%，3分；陽性細胞＞75%，4分；（2）b為染色強度評分：不著色，0分；淡黃色，1分；黃色或者棕黃色，2分；褐色或是棕褐色，3分。免疫組化最終評分為a與b評分相乘所得之積。免疫組化積分：0分，陰性（-）；1～3分，弱陽性（+）；4～6分，陽性（++）；≥7分，強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。2組AT1R及AT2R表達比較采用Mann-Whitney檢驗；實驗組AT1R及AT2R表達與臨床指標相關分析采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組AT1R和AT2R表達的比較

結果顯示，AT1R和AT2R在2組均有不同程度的表達。AT1R表達主要在腺上皮的細胞膜及細胞質(zhì)；AT2R表達在腺上皮的細胞質(zhì)和間質(zhì)細胞的核膜。AT1R表達實驗組明顯高于對照組（P＜ 0.05）；而AT2R表達實驗組明顯低于對照組（P＜ 0.05）。見圖1、表1。

2.2 實驗組AT1R、AT2R表達與臨床指標的相關分析

表1 2組AT1R和AT2R表達比較Tab.1 Expression of AT1R and AT2R between the experiment and control groups

結果顯示，實驗組患者AT1R表達水平與年齡、剖宮產(chǎn)次數(shù)及術后發(fā)病時間、結節(jié)數(shù)量、結節(jié)大小及浸潤深度不相關（均P＞ 0.05），而與CA125水平相關（P＜ 0.05）；而AT2R表達水平與年齡、剖宮產(chǎn)次數(shù)及術后發(fā)病時間、CA125水平、結節(jié)數(shù)量、結節(jié)大小及浸潤深度均不相關（均P＞ 0.05），見表2。

3 討論

腹壁子宮內(nèi)膜異位癥對育齡期婦女的健康產(chǎn)生了極大的影響。趙學英等［10］曾提出剖宮產(chǎn)等手術操作把子宮和腹腔內(nèi)游離的內(nèi)膜碎片種植到切口是導致其發(fā)病的重要原因。已有研究［11］表明子宮內(nèi)膜異位病灶需要足夠的血液供應才能在其異位部位存活。AngⅡ是一種重要的生物活性肽，具有調(diào)節(jié)血壓穩(wěn)定，促進細胞生長、分化和凋亡等作用，它的絕大部分功能是由AT1R介導的。AT1R是一種G蛋白耦聯(lián)受體，在許多組織中AT1R激活會通過下游信號分子（磷脂酶C、蛋白激酶C）以及信號轉導和轉錄激活因子發(fā)揮作用，導致細胞生長和分化反應［12］。本研究結果顯示與正常子宮內(nèi)膜組織比較，腹壁異位內(nèi)膜組織中AT1R表達明顯增高，在一定程度上也證明了血管生成對腹壁子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的重要性。

AT1R可調(diào)控腫瘤血管的產(chǎn)生，AT1R聯(lián)合AngⅡ高表達的原代乳腺上皮細胞表現(xiàn)出高侵襲性，而這種現(xiàn)象會被AT1R阻滯劑（氯沙坦）阻滯［13］。AT1R過表達與卵巢癌低存活率相關［14］。INOK等［15］對67例卵巢癌組織進行免疫組化實驗，發(fā)現(xiàn)AT1R的陽性表達率達85%，AT1R的表達水平和腫瘤內(nèi)微脈管密度乃至血管生成的表達強度均存在一定的正相關性；與AT1R染色陰性患者比較，體內(nèi)AT1R陽性表達的患者總體生存率明顯降低。DELFORCE等［16］檢測30例子宮內(nèi)膜癌患者體內(nèi)多種RAAS相關因子的表達，結果發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織AT1RmRNA表達水平顯著高于其臨近非內(nèi)膜癌組織。剖宮產(chǎn)瘢痕處腹壁異位子宮內(nèi)膜發(fā)生惡變的概率約為0.9%［17］，本研究結果顯示腹壁子宮內(nèi)膜異位癥患者AT1R表達與CA125相關（P＜ 0.05）。由此推測AT1R很可能與腹壁子宮內(nèi)膜異位癥的惡變具有一定的聯(lián)系。

表2 實驗組AT1R、AT2R表達與各臨床指標的相關分析Tab.2 Relationship between AT1R and AT2R expression and clinicopathological parameters in the experiment group

AT2R雖與AT1R共享一個核酸序列，但其同源性只有34%［18］，對于ANGⅡ有著相似的親和力。編碼AT2R的基因位于人類X染色體上，由363氨基酸組成［19］。許多研究已證實AT2R在功能上與AT1R相互拮抗。MASAKI等［20］發(fā)現(xiàn)在心臟特異性啟動子控制下AT2R基因過度表達的轉基因小鼠對AT1R介導的加壓素和變時性行為的敏感性降低。AT2R主要起到血管舒張作用，同時還發(fā)現(xiàn)外周AT2R激活也在一定程度上起到組織保護作用［5］。上調(diào)AT2R可以促進病變組織的傷口愈合和組織重建［21］。NAKAO等［8］研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位囊腫病灶中，AT2R對AT1R的拮抗作用會被抑制，AT1R和AT2RmRNA的表達水平與正常子宮內(nèi)膜差異不明顯，但這兩者之間的比率明顯高于正常子宮內(nèi)膜（P＜ 0.001）。本研究結果顯示，腹壁異位內(nèi)膜組織中AT2R的陽性表達比正常子宮內(nèi)膜組織明顯降低，而且該內(nèi)膜組織中AT1R/AT2R比正常子宮內(nèi)膜組織明顯增高，因此證明了AT1R及AT2R相互抗衡，共同參與了腹壁子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程。

綜上所述，AT1R和AT2R在腹壁子宮內(nèi)膜異位癥患者表達存在差異；AT1R和AT2R的差異性表達在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過程中起重要作用。

本研究樣本較小，且免疫組化方法也具有一定的局限性，僅證明了腹壁異位內(nèi)膜組織中AT1R的表達明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，而AT2R表達明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織，未能闡明具體的作用機制。到目前為止，針對RAAS與腹壁子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病相關的研究較少，對AT2R在RAAS中具體的作用機制還不明確，期望今后增加樣本量進一步研究論證。