microRNA-34a靶向ZEB1抑制三陰性乳腺癌細胞血管生成擬態

康樂，陶雅軍，張媛媛，陳英杰，方明

（1.大連大學醫學院基礎部生理學與病理生理學教研室，遼寧 大連 116622；2.大連醫科大學附屬第一醫院腎內科，遼寧 大連 116011）

乳腺癌是威脅全球女性生命最主要的癌癥之一。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一種具有特殊分子表型的乳腺癌亞型，其惡性度高且易發生轉移，缺乏有效的治療手段，患者預后差［1］。因而，亟需探索針對TNBC的更有效的治療方法。

血管生成擬態（vasculogenic mimicry，VM）是近年來提出的一種全新的腫瘤微循環模式。不同于經典的內皮細胞依賴的腫瘤微血管結構，VM是高侵襲性腫瘤細胞為了滿足自身的血供，通過自身變形和細胞外基質重塑而形成的一種類似血管樣的通道［2］。研究［3］顯示，TNBC中VM形成明顯高于其他乳腺癌類型，其與TNBC的高侵襲性和轉移性密切相關，也是導致抗血管生成藥物療效不佳的重要原因之一。因而，探索抑制VM的方法，將為TNBC的治療提供新的思路。

microRNA-34a（miR-34a）是具有抑癌作用的微小RNA（microRNA，miRNA）之一，參與對細胞增殖、凋亡、衰老等多種生命活動的調控。近來研究［4］顯示，TNBC患者腫瘤組織中miR-34a表達水平極低，且miR-34a的低水平表達預示患者預后較差。本課題組前期研究［5］顯示，miR-34a過表達能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移活動，但其是否參與TNBC細胞VM形成的調控目前尚無報道。本研究以TNBC細胞MDA-MB-231為研究對象，通過體外三維培養模型，采用基因過表達、Western blotting等方法探討miR-34a在TNBC細胞VM形成中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231和人胚腎細胞株HEK293T（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心），胎牛血清（美國Gibco公司），RPMI 1640培養基、MEM培養基、胰蛋白酶（美國Hyclone公司），Matrigel膠（美國BD公司），磷酸鹽緩沖液（北京索來寶生物科技有限公司），Taqman?MicroRNA Reverse Transcription試劑盒（美國Applied Biosystems公司），RNA PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），U6引物、miR-34a引物（美國Life Technologies公司），Trizol、轉染試劑 Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），血管內皮細胞鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司），基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotease 2，MMP-2）抗體、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotease 9，MMP-9）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Cell Signaling Technology公司），E-cadherin抗體、Vimentin抗體（英國Abcam公司），miR-34a模擬物及其陰性對照（negative control，NC）、si-ZEB1及si-NC片段（上海吉瑪制藥技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實時定量PCR：用TRIzol提取并測量細胞總RNA。使用Taqman法檢測miR-34a的內源性表達，以U6作為內參，測量 Ct值。以2-ΔΔCt表示miR-34a的相對表達量。

1.2.2 細胞分組及轉染：將MDA-MB-231細胞分為NC組、miR-34a組、si-NC組和si-ZEB1組。其中NC組轉染miRNA無義序列，si-NC組轉染siRNA無義序列，miR-34a組轉染miR-34a 模擬物，si-ZEB1組轉染ZEB1siRNA。取對數生長期的細胞，胰酶消化后700g離心5 min，收集細胞，調整密度接種至6孔板。以Lipofectamine 2000為轉染試劑，轉染過程按照Lipofectamine 2000說明書進行。

1.2.3 細胞的三維培養：將預冷的Matrigel 膠以50 μL/孔加至96孔板，小心搖動，使之均勻分布避免產生氣泡。將包被好的96孔板37 ℃孵箱內1 h固化。細胞轉染48 h后消化重懸，以2×104/孔種于Matrigel膠上，置于37 ℃孵箱內培養24 h后，倒置顯微鏡下觀察、拍照、計數結點數，取每個視野均值，實驗重復3次。

1.2.4 Western blotting法檢測蛋白表達水平：細胞轉染48 h后，提取各組細胞總蛋白，SDS/PAGE電泳，濕法轉移法將蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌3次。一抗VE-cadherin（1 ∶500）、MMP-2（1 ∶1 000）、MMP-9（1 ∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，HRP標記二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，孵育結束后TBST洗滌3次，每次間隔10 min。ECL發光顯色，以GAPDH（1∶1 000）為內參，檢測蛋白表達水平。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因分析：將包含野生型miR-34a結合位點的ZEB1-wt-3'非翻譯區（untranslated region，UTR）及包含 突變后miR-34a結合位點的ZEB1-mut-3'UTR分別克隆入熒光素酶報告基因載體中構建質粒。將miR-34a模擬物或其NC與野生型或突變型報告基因質粒分別共轉染入HEK293T細胞中。孵育48 h后，應用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-34a過表達效果

miR-34a模擬物轉染MDA-MB-231細胞48 h后，采用實時定量PCR檢測miR-34a的表達水平，結果顯示，與NC相比，轉染miR-34a模擬物后，miR-34a表達水平上調（57.67 ± 8.74）倍（P＜ 0.05）。

2.2 過表達miR-34a對MDA-MB-231細胞VM形成的影響

圖1 miR-34a過表達對MDA-MB-231細胞VM形成能力的影響Fig.1 Effect of miR-34a overexpression on VM formation of MDA-MB-231 cells

MDA-MB-231細胞能夠在三維培養條件下形成大小不等的網絡樣管腔結構。過表達miR-34a的MDA-MB-231細胞在Matrigel膠上形成的總節點數顯著減少（P＜ 0.05），提示miR-34a能夠顯著降低MDAMB-231細胞的VM形成能力。見圖1。

2.3 過表達miR-34a對VM形成相關分子標志物表達的影響

采用Western blotting檢測2組細胞VM形成相關分子標志物的表達水平。結果顯示，與對照組相比，過表達miR-34a的MDA-MB-231細胞中，VM形成標志物VE-cadherin、MMP-2及MMP-9的表達水平顯著降低（P＜ 0.05），提示過表達miR-34a能夠降低VM形成相關分子標志物的表達水平。見圖2。

圖2 miR-34a過表達對VM形成相關分子標志物表達的影響Fig.2 Effect of miR-34a overexpression on VM markers

2.4 miR-34a靶向結合ZEB1

應 用 miRanda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）預測發現，miR-34a與ZEB1之間存在結合位點（圖3A）。雙熒光素酶報告基因分析結果（圖3B）顯示，ZEB1-wt-3' UTR+miR-34a模擬物組熒光素酶活性較ZEB1-wt -3' UTR+NC組顯著下降（P＜0.05），而ZEB1-mut-3' UTR+miR-34a模擬物組熒光素酶活性與ZEB1-mut-3'UTR+NC組相比無明顯變化，證實miR-34a靶向抑制ZEB1表達。

圖3 miR-34a靶向抑制ZEB1Fig.3 miR-34a directly targets ZEB1

2.5 沉默ZEB1對MDA-MB-231細胞VM形成的影響

si-ZEB1轉染MDA-MB-231細胞后，采用三維培養觀察VM形成變化。結果顯示，與對照組相比，si-ZEB1組細胞VM形成顯著下降（P＜ 0.05），提示ZEB1是參與MDA-MB-231細胞VM形成的重要調控因子。見圖4。

2.6 沉默ZEB1對MDA-MB-231細胞的上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程的影響

圖4 沉默ZEB1對MDA-MB-231細胞VM形成的影響Fig.4 Effect of ZEB1 silencing on VM formation of MDA-MB-231 cells

采用Western blotting檢測各組細胞EMT相關因子E-cadherin和Vimentin表達的變化。結果顯示，沉默ZEB1后，E-cadherin表達顯著增加，而Vimentin表達顯著下降（P＜ 0.05），提示沉默ZEB1可抑制MDAMB-231細胞的EMT進程。見圖5。

圖5 沉默ZEB1對MDA-MB-231細胞EMT過程的影響Fig.5 Effect of ZEB1 silencing on EMT in MDA-MB-231 cells

3 討論

TNBC是臨床上最具侵襲性的乳腺癌亞型之一。盡管TNBC的診斷和治療已有較大進展，但由于該病易復發和轉移，患者預后極差。VM是高侵襲性腫瘤細胞相互連接而形成的一種血管樣通道。它能夠為腫瘤細胞提供營養支持，使其獲得更具侵襲性的表型，并能將腫瘤細胞帶入微循環，從而轉移到其他器官［6］。多項研究證實，VM形成是促進TNBC腫瘤細胞侵襲和遷移的重要因素。

miRNA是一類長約18×103～22×103的非編碼小RNA，它們能夠誘導靶mRNA降解或抑制靶mRNA翻譯，在轉錄后水平調控基因表達。一部分miRNA具有癌基因或抑癌基因的功能，與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關。近年來研究發現，miRNA與腫瘤VM形成的調控密切關聯。LI等［7］報道miR-141能夠通過抑制EphA2的表達抑制膠質瘤的VM形成，WAN等［8］報道miR-124能夠通過靶向AmotL1在頭頸部腫瘤中抑制VM形成。miR-34a是一種能夠抑制腫瘤新生血管形成的miRNA［9］，但其是否參與腫瘤細胞VM形成尚無研究報道。本研究以TNBC細胞MDAMB-231為研究對象，通過體外實驗首次發現，過表達miR-34a能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞的VM形成，提示miR-34a可能為抑制TNBC細胞VM形成的重要因子。

越來越多的證據表明，EMT過程可以通過促進細胞的可塑性、重塑細胞外基質等機制促進VM形成，在惡性腫瘤的轉移和VM形成中起到關鍵性作用［10］。ZEB1是參與EMT調控的關鍵因子。臨床研究［11］發現，ZEB1高表達可作為預示TNBC患者低生存率的獨立預后因子。近期研究發現，ZEB1參與腫瘤細胞的VM形成。LIU等［12］的結腸直腸癌研究結果顯示，VM陽性的樣本中ZEB1表達上調且與EMT特征相關。敲低ZEB1能夠減少VM形成，恢復腫瘤細胞的上皮表型，并抑制腫瘤的侵襲和遷移。本研究在TNBC細胞MDA-MB-231中觀察到，沉默ZEB1能夠顯著減少VM形成，同時抑制腫瘤細胞的EMT過程，提示EMT調控關鍵因子ZEB1可作為抑制TNBC細胞VM形成的重要靶點。生物信息學分析顯示，ZEB1是miR-34a的靶基因，且雙熒光素酶報告基因分析結果顯示，miR-34a能夠靶向抑制ZEB1的表達。因此推測，miR-34a抑制TNBC細胞VM形成的機制可能與其靶向抑制ZEB1，抑制腫瘤細胞EMT過程有關。

綜上所述，本研究首次發現miR-34a能夠抑制TNBC細胞的VM形成，其機制可能與靶向ZEB1抑制EMT過程有關。本研究將為TNBC中抑制VM的治療策略提供新的實驗依據。