雌二醇和同型半胱氨酸對人臍靜脈內皮細胞增殖和凋亡的影響

陳海英，劉雨琪

（中國醫科大學附屬第一醫院產科，沈陽 110001）

深靜脈血栓形成是由于血液在深靜脈內不正常凝結導致的靜脈回流障礙性疾病，常常在下肢發生［1］。血栓形成后，除少數能自行消融或局限于發生部位外，大部分會擴散至整個肢體的深靜脈主干，若不及時診斷和處理，多數會演變為血栓，形成后遺癥，長時間影響患者的生活質量。還有一些患者可能并發肺栓塞，造成極為嚴重的后果。妊娠期纖溶凝血系統特殊的生理性改變，可以減少分娩后胎盤剝離面出血和裂傷處出血，但同時也增加了動靜脈血栓形成的機會［2］。妊娠期女性發生靜脈血栓的風險是同齡女性的5倍，是導致孕產婦死亡的主要原因之一［3］。

很多研究［4］證實，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocystinemia，HHcy）是動靜脈血栓形成的獨立危險因素，HHcy也與多種不良妊娠結局關系密切，如流產、子癇前期、胎兒宮內發育受限等，但HHcy是否與妊娠期靜脈血栓形成有關卻罕有報道。而且大量研究［5-6］證實了雌二醇（estradiol，E2）具有抑制血管內皮細胞凋亡和促進血管內皮細胞增殖的作用，對血管內皮細胞來說是保護性因子。E2是否與妊娠期靜脈血栓形成有關未見報道。本課題組前期研究［7］發現，妊娠期靜脈血栓患者血清E2水平下降而同型半胱氨酸（homocystinemia，Hcy）水平升高，推測E2和Hcy與妊娠期靜脈血栓形成有關，但其具體機制仍需進一步研究［7］。WILMANNS等［8］發現，亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）的基因多態性與深靜脈血栓患者血清Hcy水平相關，推測Hcy促進靜脈血栓形成的原因可能與MTHFR有關。

本研究通過觀察E2與Hcy對人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）增殖和凋亡的影響，探討E2與Hcy是否為妊娠期靜脈血栓形成的保護因素與危險因素；通過檢測Hcy代謝關鍵酶MTHFR的表達，探討E2對Hcy的可能調控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

HUVEC購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，RPMI 1640培養基購自美國Hyclone公司，E2和Hcy購自美國Sigma公司，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染凋亡試劑盒和CCK-8試劑盒購自中國凱基公司，RNA提取試劑盒、SYBR實時定量試劑盒和反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 HUVEC的培養

HUVEC培養基是含10%胎牛血清的RPMI 1640，培養條件為37 ℃、5% CO2，適時換液傳代。

1.3 CCK-8法檢測HUVEC增殖能力

將細胞分為對照組、E2組（E2濃度分為1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6μmol/L），Hcy組（Hcy濃度分為1×10-5、3×10-5、6×10-5、1×10-4μmol/L）。調整HUVEC濃度為1×104/mL，接種于96孔板，每孔接種量是100 μL，加入相應處理因素至目標濃度。CCK-8法檢測時間點分別是24、48、72 h，加入10 μL CCK-8，繼續培養4 h后應用酶標儀490 nm波長檢測光密度值。選取E2和Hcy作用的最適濃度，分為對照組、E2組、Hcy組和E2+Hcy組，再次應用CCK-8法檢測培養24、48和72 h細胞的增殖能力。

1.4 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術檢測HUVEC凋亡

應用E2和Hcy培養各組細胞72 h（與1.3中的分組和最適濃度相同），收集細胞，調整細胞濃度為1×106/mL。應用冷PBS吹打后，離心細胞2遍，應用緩沖液重新懸置細胞。取出細胞懸液500 μL，分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶，于4 ℃中避光孵育細胞30 min，最后應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 實時定量PCR檢測HUVEC中MTHFR mRNA表達

應用E2和Hcy培養各組HUVEC 72 h（與1.3中的分組和最適濃度相同）。應用Traziol提取總mRNA。根據反轉錄試劑盒說明，RNA反轉錄合成cDNA的條件是37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。反應體系為12.5 μL SYBR Premix EaqTMⅡ（2×）、1 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L）、1 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L）、2 μL模板cDNA、dH2O（滅菌蒸餾水），反應總體積共25 μL。實時定量PCR擴增反應條件是95 ℃ 30 s，1個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，1個循環。MTHFR上游引物：5'-TGAAGG AGAAGGTGTCTGCGGGA-3'，下游引物：5'-AGGAC GGTGCGGTGAGAGTG-3'。

1.6 Western blotting檢測HUVEC中MTHFR蛋白表達

應用E2和Hcy培養各組HUVEC 72 h（與1.3中的分組和最適濃度相同）。細胞加細胞裂解緩沖液（cat#P0013，中國Beyotime公司）破碎后提取蛋白，應用BCA蛋白質測定法（中國Beyotime公司）檢測蛋白質濃度。取30 μg蛋白，使用10% Tris-甘氨酸凝膠的SDS-PAGE分離。將分離的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜（美國Millipore公司）上，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉。應用鼠抗人MTHFR（1 ∶2 000，美國Abcam公司）一抗4 ℃過夜，用HRP標記的抗鼠二抗（1 ∶10 000，中國Vazyme公司）和增強化學發光（美國Millipore公司）顯色。使用ImageJ軟件進行光密度分析。應用GAPDH（1 ∶5 000，美國Abcam公司）做對照，進行半定量分析。

1.7 統計學分析

應用SPSS 13.0軟件對所有數據進行統計分析，計量資料用表示，采用t檢驗進行比較，計數資料采用方差分析進行比較，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HUVEC的增殖能力

E2可以促進HUVEC增殖，在1×10-8μmol/L濃度下作用72 h時效果最明顯，與對照組及24 h比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。Hcy能使HUVEC增殖減慢，在1×10-4μmol/L濃度下作用72 h時抑制增殖作用最明顯，與對照組及24 h比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1。

將E2與Hcy以最適濃度共同加入到細胞中，分為對照組、E2（1×10-8μmol/L）組、Hcy（1×10-4μmol/L）組和E2（1×10-8μmol/L）+Hcy（1×10-4μmol/L）組。結果發現，E2+Hcy組與Hcy組相比，24、48、72 h時細胞增殖明顯增多，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

2.2 各組細胞凋亡率

表1 不同濃度E2與Hcy作用于HUVEC不同時間的OD值Tab.1 OD values at different time points in HUVECs treated with different concentrations of E2 and Hcy

表2 最適濃度E2和Hcy作用于HUVEC不同時間的OD值Tab.2 OD values at different time points in HUVECs treated with the most suitable concentrations of E2 and Hcy

流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況，凋亡率對照組 為（1.59±0.07）%，1×10-9μmol/L E2組 為（1.67±0.23）%，1×10-8μmol/L E2組為（0.98±0.03）%，1×10-7μmol/L E2組 為（1.23±0.05）%，3×10-5μmol/L Hcy組為（6.22±0.40）%，6×10-5μmol/L Hcy組為（10.64±0.78）%，1×10-4μmol/L Hcy組為（16.79±1.01）%。E2組與對照組相比HUVEC凋亡受到抑制，1×10-8μmol/L E2組凋亡率明顯低于對照組（P＜ 0.05）。Hcy組與對照組相比明顯促進HUVEC凋亡，1×10-4μmol/L Hcy組凋亡率明顯高于對照組（P＜ 0.05）。最適濃度E2（1×10-8μmol/L）和Hcy（1×10-4μmol/L）共同作用于HUVEC，凋亡率為（1.06±0.06）%，與Hcy組相比，能夠抑制Hcy誘導的HUVEC凋亡。見圖1。

2.3 HUVEC中MTHFR mRNA表達

圖1 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率Fig.1 Apoptosis rate detected by flow cytometry

與對照組相比，E2組、Hcy組、E2+Hcy組MTHFRmRNA的相對表達分別為1.85±0.045、1.01±0.011、1.76±0.023，E2組、E2+Hcy組表達明顯升高（P＜0.05），Hcy組無明顯變化。

2.4 HUVEC中MTHFR蛋白表達

Western blotting結果顯示，與對照組相比，E2組、Hcy組、E2+Hcy組MTHFR的相對表達分別為1.43±0.023、1.03±0.012、1.42±0.018，E2組、E2+Hcy組表達明顯升高（P＜ 0.05），Hcy組無明顯變化。見圖2。

圖2 Western blotting檢測HUVEC中MTHFR蛋白的表達Fig.2 Expression of MTHFR protein in HUVECs detected by Western blotting

3 討論

血管內皮細胞為襯覆于血管內腔面的單層扁平細胞，增殖和凋亡平衡是其保持自身正常結構和功能的基礎。內皮細胞的凋亡過度或增殖不足，導致血管壁受損，可以促進血小板的黏附和血栓的形成，這是引起血栓的一個重要原因。妊娠期血流停滯、血液高凝狀態和血管壁損傷是妊娠期深靜脈血栓形成的主要原因，所以研究血管內皮細胞增殖和凋亡的平衡，有助于揭示妊娠期靜脈血栓形成的原因，進而提供有效防治妊娠期靜脈血栓靶點的理論依據。

Hcy是在蛋氨酸代謝過程中產生的含硫氨基酸。已在多種疾病中觀察到Hcy水平升高，如心血管疾病、動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風、最小認知障礙、癡呆、帕金森病、多發性硬化、癲癇和子癇。HHcy對血管和神經系統都有直接的毒性作用。近年來大量的研究已經證實，Hcy代謝異常是血液高凝狀態形成的重要原因之一，是動靜脈栓塞性疾病的獨立危險因素。HHcy導致血栓形成的具體致病機制尚不完全清楚，目前醫學界比較公認的幾個機制是：破壞血管內皮，激活血小板，活化凝血因子，抑制抗凝系統，破壞纖溶系統。歐三桃等［9］發現，S-腺苷Hcy可以抑制大鼠主動脈內皮細胞的增殖并促進其凋亡，進而導致內皮細胞功能異常。本課題組前期研究［7］也證實，妊娠期靜脈血栓的患者血液中Hcy水平明顯高于正常孕婦，推測HHcy通過促進血管內皮細胞凋亡抑制增殖，達到促進妊娠期靜脈血栓形成的作用。本研究證實了高Hcy能夠促進HUVEC凋亡，并抑制其增殖。

在生理條件下，Hcy濃度在正常妊娠期間下降［10］。妊娠期雌激素水平升高，推測作為血管保護因子，雌激素可能通過某種機制參與調控妊娠期血漿中Hcy的水平，防止妊娠期處于血栓前狀態，進一步發展形成血栓。本研究發現，E2能夠促進血管內皮細胞增殖，抑制血管內皮細胞凋亡。E2與Hcy共同作用于HUVEC與單獨Hcy作用相比，可以明顯促進細胞的增殖、抑制細胞的凋亡，說明E2可以有效抑制Hcy破壞血管內皮細胞功能的作用，達到防治深靜脈血栓形成的目的。

MTHFR是體內葉酸代謝和Hcy甲基化的關鍵酶。本研究通過實時定量 PCR檢測各組細胞中MTHFR基因的表達情況。結果顯示，E2可以上調HUVEC中MTHFR的表達，Hcy不增加MTHFR的表達，E2與Hcy共同作用同樣使MTHFR的表達上調。因而推測，E2可能通過調節MTHFR的表達來發揮內皮細胞保護功能，抑制Hcy對臍靜脈內皮細胞的促凋亡功能，但其具體機制還需進行深入研究。