缺磷響應基因OsSQD2.1對水稻生長發育的影響

劉璐 許傳山 孫雅菲 胡志 艾昊 劉秀麗 王小文,4 孫淑斌,*

缺磷響應基因對水稻生長發育的影響

劉璐1許傳山2孫雅菲3胡志1艾昊1劉秀麗1王小文1,4孫淑斌1,*

（1南京農業大學 資源與環境科學學院，南京 210095；2臨沂市蘭山區農業局, 山東 臨沂 276000；3上海市農業科學院 生態環境與保護研究所, 上海 201403;4南京農業大學 園藝學院 園林系，南京 210095；*通信聯系人，E-mail: sunshubin@njau.edu.cn）

【】旨在研究水稻缺磷響應基因對水稻生長發育的影響，從而解析其作用。通過生物信息學的方法，確定基因及蛋白結構并分析啟動子上的順式作用元件；通過熒光定量PCR檢測，研究不同缺素條件下的表達；測定T-DNA插入突變體和沉默干涉材料不同時期表型、磷含量和凈光合速率，研究對轉基因植株生長發育及光合作用的影響。基因編碼區全長為3548 bp，位于第1染色體上，具有11個外顯子和10個內含子，OsSQD2.1屬于糖基轉移酶家族；啟動子上含有多個缺磷響應順式作用元件；受缺磷誘導，缺硫抑制。營養生長期突變體或沉默材料地上部長度和主根長均顯著低于野生型。生殖生長期，突變體或沉默材料株高和千粒重顯著低于野生型，結實率無顯著差異。的突變與沉默增加正常供磷時葉片中的總磷，在缺磷條件時野生型相比無明顯差異；此外，苗期和成熟期突變體的凈光合速率顯著低于野生型，初步推測影響水稻凈光合速率。受缺磷響應，并影響水稻生長發育。

磷; 缺磷響應; 缺磷; 水稻; 生長發育

磷(phosphorus, P)在植物體內含量約占植物干質量的0.05%～0.50%，是植物生長發育必需的大量營養元素之一[1]。它是生物體內生物膜、蛋白質、核酸、磷脂、ATP等重要物質的組成成分，廣泛參與植物體內碳水化合物轉運、糖類物質及脂類物質的代謝等過程，并在種子萌發、花粉發育和果實的形成等過程中起重要作用[2-6]。植物主要吸收土壤溶液中的正磷酸鹽滿足自身需求(Pi)，由于其易被土壤中的鈣、鐵、鋁等固定，土壤磷有效性低成為植物生長的重要限制因子[7]。

為了適應磷缺乏環境，植物在長期的進化過程中形成了一系列的適應性機制[8-9]。缺磷條件下，葉綠體類囊體中的磷脂（肌醇-6-磷酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇）降解，釋放可溶性磷酸鹽，同時糖脂(單半乳糖甘油二脂和雙半乳糖甘油二脂）和硫脂（SQDG）合成增加，功能上回補磷脂是常見的植物適應缺磷脅迫環境的機制之一[10-12]。目前，硫代異鼠李糖甘油二酯（簡稱硫脂，SQDG）的合成已經明確需要三個反應[13]。首先，通過尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶3(UGP3)將1-磷酸葡萄糖轉化為尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)[14]。然后尿苷二磷酸硫代異鼠李糖合酶（Sulfoquinovosyl diacylglycerol 1, SQD1）將尿苷二磷酸葡萄糖轉化為尿苷二磷酸硫代異鼠李糖(UDP-SQ)[11, 15-16]。在最后一步中，硫代異鼠李糖甘油二酯合酶(Sulfoquinovosyl diacylglycerol 2, SQD2)將甘油二酯（DAG）與尿苷二磷酸硫代異鼠李糖反應生成硫代異鼠李糖甘油二酯[15-17]。所編碼的SQD2酶除了能夠催化SQDG的合成外，還可以在缺磷時催化生成葡糖醛酸基甘油二酯（GlcADG）[14]。比較而言，GlcADG與SQDG結構相似，但擬南芥中GlcADG只在缺磷條件下合成，正常供磷條件下則不能合成GlcADG；此外，擬南芥在缺失GlcADG時葉綠素分解加快，植株變白，最終會嚴重破壞擬南芥自身生長。由此可知，在缺磷條件下GlcADG有助于擬南芥生長[10,14]。

國內外對水稻家族基因已有一定研究基礎，并已證實了在水稻中有三個2的同源基因，根據同源性高低，分別將它們命名為（）,和[18]。的基因功能已被部分報道，OsSQD2.2與UDP-SQ不能直接生成SQDG，但在參與類黃酮合成以及介導水稻一級和二級糖分配的過程中均起了重要作用[17]。水稻中的功能尚未明確。本研究通過生物信息學手段分析了的基因及氨基酸結構、啟動子順式作用元件和在不同缺素下的表達模式，為研究的生物學功能奠定了基礎。同時，利用創制的轉基因材料，研究了對水稻不同生育期生長發育的影響，旨在揭示該基因通過調控養分利用，從而影響水稻生長發育的機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻材料包括水稻日本晴、中花11、突變體材料（購于華中農業大學突變體庫）和RNAi株系（-Ri1、-Ri2，本實驗室孫雅菲師姐構建）。

1.2 OsSQD2.1的序列分析及克隆

根據擬南芥的(AF454354)基因序列在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）做BLASTx分析得到水稻中同源基因（Os07g0100300)，（Os01g0142300），（Os03g0265 100），并可知基因結構。根據GeneBank公布的全長cDNA序列設計引物，以水稻日本晴葉片的cDNA為模板，擴增得到的全長編碼框（open reading frame，ORF）。經測序確定其實際的cDNA序列，并與網站上公布的cDNA序列和基因組序列，利用DNAMAN軟件比對分析，以確定其內含子和外顯子的結構。引物合成和測序由南京金唯智生物公司完成。

1.3 OsSQD2.1基因啟動子基序分析

基因的表達受上游相關轉錄因子的調控，而轉錄因子對基因的調控是通過與順式調控元件作用完成的。通過Softberry軟件和RSA-Tools（http://rsat. ulb.ac.be/rsat/）軟件來分析基因轉錄起始位點和順式作用元件分布的位置和數量（啟動子長度為2184 bp）。本研究分析的與磷酸鹽脅迫相關的順式作用元件包括W-box（TTGACY），P1BS（GNATATNC）和PHO-like元件（GDHGTGG）。

1.4 植物生長條件與缺素表達模式檢測

為了研究在不同元素缺乏處理下的表達模式，對野生型（日本晴）進行了不同營養元素（P、S）缺乏處理。將水稻野生型種子經30%次氯酸鈉（NaClO）消毒30 min后，用自來水清洗5~6次，直至將殘留的次氯酸鈉洗凈。隨后將洗好的種子放于水面，并置于37℃恒溫培養箱，暗培養2~3 d催芽，待露白后，將種子移動至人工氣候室，人工氣候室溫度為20℃~32℃，光照周期14 h（晝）/10 h（夜），并用1/2營養液培養[19]。待水稻長至兩葉一心后移栽至中轉箱，并分別進行缺磷（0 μmol/L Pi, –P）和缺硫（20 μmol/L S, –S）處理，7 d后分別采根和地上部樣品。使用Trizol提取葉片總RNA，然后用Vazyme反轉錄試劑盒進行反轉錄。以上均按試劑盒說明書進行操作。根據NCBI網站提供的mRNA序列，利用引物設計軟件Primer 5.0設計的定量引物，并以水稻基因（Os03g0718100）為內參基因，和引物序列詳見表1。常規qRT-PCR體系均為 20μL：PCR預混液10μL，上下游引物各1 μL，模板(基因組 DNA或 cDNA）1μL，雙蒸水7μL。

表1 OsActin和OsSQD2.1的定量PCR序列

1.5 轉基因材料水培實驗

野生型和轉基因材料用1/2 MS培養基發苗，7 d后選取長勢一致的幼苗移入15 L培養箱中，每箱30株苗，先清水緩苗然后全營養液培養。全營養液成分參照IRRI水稻完全營養液配方[20]。營養液用4 mol/L HCl調pH至5.5，每2 d換一次營養液。水培3周后觀察表型并統計相關生理數據。

1.6 轉基因材料磷含量的測定

在成熟期時取盆栽野生型、轉基因材料的葉片，105℃下殺青30 min后于70℃下烘至恒重，磨碎，稱取磨碎的植株樣品0.05 g，采用硫酸-雙氧水消煮法和鉬銻抗比色法測定總磷含量。

1.7 轉基因材料盆栽實驗

待野生型、突變體及沉默干涉材料長至三葉一心時，分別將中花11、純合突變體、-RNAi株系Ri1、Ri2移至桶中，進行盆栽實驗。盆栽實驗在南京農業大學牌樓實驗基地進行，土壤為江蘇省南京地區酸性黃棕壤。土壤中的全氮含量為0.91 g/kg，有效磷含量18.91 mg/kg，速效鉀含量185.67 mg/kg，有機質含量11.56 g/kg；pH值為5.08。每桶裝15 kg土壤，磷肥施用量為160 mg/kg，氮肥分三次施入基肥0.1 g/kg，分蘗肥0.15 g/kg，穗肥0.06 g/kg，不施鉀肥（所用土壤中速效鉀含量較高），每個株系5個重復。在成熟期分別對野生型、突變體及沉默干涉材料的株高、結實率、千粒重等農藝性狀進行考查。

1.8 OsSQD2.1突變體及沉默材料凈光合速率測定

處理材料分別為苗齡為30 d正常供磷的水培苗（培苗方法參考1.5）以及成熟期土培水稻（田間種植參考1.7）。使用Li-Cor 6400型光合作用測定儀的紅藍光源分別于人工氣候室9:00?15:00和田間9:00?12:00測定新完全展開葉的凈光合速率。葉室內的光照強度為1500 μm/(m2?s), CO2濃度為400~ 420 μm/mol(大氣CO2濃度),葉片溫度和葉室內空氣濕度分別控制在25℃~28℃和40%~60%。將葉片放入葉室后，待數據穩定時(約需10 min)記錄數據。

1.9 數據統計分析

所有測定數據在Graphpad Prism 6.0中整理，經SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 OsSQD2.1基因與蛋白結構分析

是呈組成型表達并能夠編碼合成硫代異鼠李糖甘油二酯合成酶SQD2的基因，定位在擬南芥第1染色體上。將基因序列在NCBI進行同源搜索，水稻中獲得3個同源基因，按其同源性高低分別命名為和[18]。BLAST和GenomeScan分析表明，位于水稻第1染色體上；基因的編碼區全長為3548 bp。如圖1所示，和分別含有11、11、11和10個外顯子。在水稻和擬南芥中，基因均是由兩端較長的外顯子和中間較短的外顯子構成。其中，水稻基因的第1外顯子比擬南芥中基因少233 bp，而最后一個外顯子卻比擬南芥中的多266 bp。兩基因核酸相似性最高為84%。經NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）蛋白結構域分析，比較AtSQD2及OsSQD2家族三個基因蛋白結構域(圖1-B)，發現三個基因編碼的蛋白質均具有糖基轉移結構域GT-like，由此可知，OsSQD2.1、OsSQD2.2、OsSQD2.3與擬南芥SQD2同屬于糖基轉移酶家族中的GT-like家族。

A－AtSQD2、OsSQD2.1、OsSQD2.2及OsSQD2.3基因的內含子和外顯子長度與位置；白色方塊代表UTR區域，黑色方塊代表外顯子，直線代表內含子；數字代表各區域的堿基數。B－氨基酸結構及關鍵結構域；黑色方塊代表GT-like結合結構域，黑色方塊上方的數字代表此結構域所在氨基酸的位置。

Fig. 1.Comparison of genes and domain structures ofin rice and.

圖2 OsSQD2.1基因啟動子順式作用調控元件分析

Fig. 2. Motif analysis of the identified promoters of

2.2 OsSQD2.1基因啟動子基序分析

通過運用RSA-Tools(http://rsat.ulb.ac.be/rsat/)對OsSQD2.1進行啟動子分析，結果顯示在的啟動子中含有3個W-box基序(TTGACY)，2個PHO-like元件基序(GDHGTGG)和3個P1BS基序(GNATATNC)，推測可能受缺磷調控(圖2)。

2.3 OsSQD2.1的缺素表達模式

擬南芥中合成SQDG需要亞硫酸鹽參與，且缺硫會影響編碼合成UDPG的UGP3的基因表達量[13-14]，同時分析發現啟動子區域內含有與缺磷相關的順式調控作用元件PIBS和W-box。在此基礎上驗證是否受缺磷及缺硫響應。如圖3所示，在水培缺磷及缺硫處理7 d后檢測發現，缺磷處理時無論在地上部或根部的表達量均顯著上調而在缺硫處理時的表達量顯著下調。該結果表明受缺磷誘導，并受缺硫抑制。

2.4 OsSQD2.1基因T-DNA插入的突變體的獲得與鑒定

根據基因序列信息，從華中農業大學國家植物基因研究中心（武漢）創建的水稻增強子捕獲系T-DNA插入突變體庫購買突變體號為RMD_04Z11FO86的突變體株系。根據網站提供的信息可知，中外源T-DNA插入在第1外顯子中（圖4-A）。隨后通過兩輪PCR擴增法鑒定獲得突變體純合體（圖4-B、C）。第一輪PCR引物分別位于目的基因片段的5′和3′端的側翼基因序列上，用以鑒定該基因上有沒有T-DNA插入所導致的無法正常轉錄現象；第二輪PCR引物分別位于T-DNA序列和側翼基因序列上，以確保T-DNA插入的存在。所以，當且僅當第一輪PCR無片段擴出而第二輪PCR有特異性片段擴出時，可鑒定并判斷在該等位基因上有T-DNA的插入，即該基因的突變純合體。因此，我們首先利用LP、RP和BP（引物位置如圖4-A所示）進行兩輪PCR驗證，隨后采用RT-PCR技術，利用引物P3和P4（引物位置如圖4-A所示）對獲得的純和突變體進行進一步的半定量分子鑒定（圖4-A）。經兩輪PCR鑒定可知，所購買突變體株系在第一個外顯子確有T-DNA的插入（圖4-B），半定量分子鑒定表明，T-DNA插入的確導致了該基因無法正常轉錄，完全沉默（圖4-C）。

不同字母表示顯著性差異達到5%水平。下圖同。

Fig. 3. Relative expression ofin response to phosphorus deficiency(-P) and sulfur deficiency(-S).

2.5 OsSQD2.1突變與沉默對水稻苗期表型的影響

為了研究缺失和突變后對水稻營養生長階段的影響，對純合突變體和RNAi材料（Ri1和Ri2）進行水培幼苗的表型鑒定（圖5）。發芽3周后，觀察到與野生型相比，和-RNAi生長明顯受抑制（圖5-A），其中，突變體和RNAi材料根部及地上部長勢明顯弱于野生型。和-RNAi地上部長度顯著矮于野生型，其中，突變體地上部比野生型矮了43%（圖5-B）。此外，和-RNAi的主根長度明顯比野生型短小，長度依次為WT＞Ri2＞＞Ri1（圖5-C）。這些結果表明，的缺失和沉默抑制了水稻營養生長期的生長發育。

A—OsSQD2.1突變體插入信息；B, C—兩輪PCR鑒定純合體及RT-PCR鑒定沉默效果。

Fig. 4. Identification of homozygous T-DNA insertion mutants of

2.6 OsSQD2.1突變與沉默對水稻成熟期葉片磷含量的影響

為了研究突變對生殖生長階段的水稻植株葉片磷濃度的影響，設置160 mg/kg（模擬正常供磷）和0 mg/kg（缺磷）的磷處理。結果如圖6所示，正常供磷條件下，與野生型相比，和-RNAi株系葉片中的總磷含量有顯著增高的趨勢。這三個株系葉中的總磷含量分別增加了30.7%、38.4%、23%。而缺磷條件下與野生型相比突變體或沉默干涉材料總磷含量無明顯差異。

圖5 OsSQD2.1突變體及沉默材料(Ri1和Ri1)的苗期表型

Fig. 5.Phenotype ofmutation and silencing(Ri1 and Ri1) at seedling stage(Mean±SE,=5).

圖6 正常供磷和缺磷條件下盆栽實驗中野生型、ossqd2.1和OsSQD2.1-RNAi材料(Ri1和Ri1)葉片總磷含量

Fig. 6. Total P concentration in leaves of pot-cultured wild type,and-RNAi materials(Ri1 and Ri1) under Pi-sufficient and Pi-deficiency conditions(Mean±SE,=5).

圖7 OsSQD2.1突變體及沉默材料(Ri1和Ri1)農藝性狀分析

Fig. 7. Phenotype of WT,and-RNAi lines(Ri1 and Ri1) at maturity stage(Mean±SE,=5).

2.7 OsSQD2.1的突變和沉默抑制水稻生殖生長階段的株高

通過鑒定成熟期、-RNAi與野生型的表型，發現成熟期突變體與-RNAi的生長同樣受到抑制（圖7-A）；突變體與RNAi材料的株高均明顯低于野生型（圖7-B），其中突變體株高比野生型低了17.3%。與野生型相比，突變體或沉默材料的千粒重顯著降低，其中與野生型相比突變體結實率約下降41%（圖7-D），結實率無明顯差異（圖7-C）。以上結果說明的突變與沉默除了影響營養生長期水稻的生長之外，對生殖生長階段水稻的生長同樣起了抑制作用。

2.8 OsSQD2.1的突變與沉默抑制水稻凈光合速率

為了研究缺失和突變后對水稻不同時期凈光合速率的影響，分別對鑒定所得的純合突變體和RNAi材料（Ri1和Ri2）水培苗以及野生型和純合突變體于田間土培苗進行凈光合速率測定。結果如圖8所示，水稻營養生長期與野生型相比，和-RNAi凈光合光合速率顯著降低，生殖生長期在田間突變體的凈光合速率相對于野生型仍明顯降低，且該時期的凈光合速率低于營養生長期。推測可能影響水稻光合作用。

圖8 OsSQD2.1突變體與沉默干涉材料(Ri1和Ri1)苗期(A)和成熟期(B)凈光合速率

Fig. 8. Net photosynthetic rate of WT,and-RNAi lines(Ri1 and Ri1) at the seedling stage(A) and the maturity stage(B) (Mean±SE,=5).

3 討論

是模式生物擬南芥中已被報道參與合成硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG）以及缺磷條件下又可生成葡糖醛酸基甘油二酯β-葡糖醛酸酶(GlcADG)的酶基因[10,13]。根據它的基因序列及蛋白功能結構域BLAST所獲得的水稻中的同源基因有三個，按同源性高低分別命名為和[18]。其中，已被報道，OsSQD2.2與UDP-SQ不能直接生成SQDG，但它在類黃酮合成以及介導水稻一級和二級糖分配的過程中均起重要作用[18]。本研究通過對進行啟動子分析，發現該基因的啟動子含有3個W-box基序，2個PHO-like元件基序和3個P1BS基序，故而推測可能受缺磷調控。基因也明顯受缺磷誘導[14]。本研究對該基因在不同供磷條件下進行檢測，結果表明，在缺磷條件下水稻地上部和根部中的表達量均出顯著上調。由此可見，與均為缺磷響應基因，且在磷素營養吸收與利用過程中行使功能。擬南芥中，AtSQD2所參與的酶促反應生成SQDG需要亞硫酸鹽[15-17]，在缺硫條件下該反應受抑制。水稻中，在缺硫條件下的表達與缺磷相反，的表達量在地上部和根部中均顯著下調。這一結果表明可能為編碼合成硫代異鼠李糖甘油二脂的酶的基因，且水稻中該反應同樣需要硫的參與。總的來說，除了對磷響應之外，還響應硫，說明可能參與磷素和硫素的積累和利用過程。

自然界中，由于磷（P）肥易于固定在土壤中，且利用效率非常低，磷饑餓已成為提高作物產量和改善質量的主要限制因素之一[20]。近年來，已有研究報道表明，OsPHR2是調控Pi穩態網絡的中央轉錄因子，OsPHR2作為監管中心可以控制至少兩個途徑：第一個途徑是PHR2-MiRNA399-PHO2，這一途徑包含一系列基因，包括和[19]，[21]，[22]和[23]。這些基因的過表達轉基因水稻品系或抗性水稻突變體均具有P中毒的表型，葉片上有許多褐變點，并且Pi含量增加了。

國內外對水稻基因的研究仍然很少，但已證實該基因受缺磷誘導。為缺磷信號途徑中的轉錄因子，的沉默導致的表達量下降，并削弱其響應缺磷的能力[21]；OsMYB2P-1是轉錄因子，受缺磷誘導。超表達材料中地下部表達量明顯上調；而干涉材料中地上部的表達量遠低于超表達材料地上部[24]。而在OsSPX1-RNAi材料中的表達量明顯降低[21]。可以推斷水稻基因受和的正調控和的負調控。是否受的調控還不得而知。

水稻種子根是由胚發育而來且在幼苗期發揮著主要作用，水稻根系主要由胚后發育的不定根和側根構成。不定根與種子根一樣，都具有十分重要的作用，它能夠促進水稻淹水狀態下對養分和水分吸收以及氣體交換。本研究發現，的突變和沉默顯著抑制了水稻苗期主根的生長發育，說明水稻營養生長期影響了其生長發育。的突變體和沉默對水稻生殖生長期的株高和千粒重均有抑制作用，對結實率無明顯影響。結合苗期野生型和轉基因材料表型觀察可知，對水稻苗期和成熟期的生發發育均有影響。正常供磷條件下的突變或沉默促進了總磷在葉片中的積累，推測參與了水稻磷素吸收和積累過程。本研究還發現苗期和成熟期突變體的凈光合速率均顯著小于野生型，故而推測在水稻光合作用中起到一定作用，而影響水稻不同時期的生長發育可能是通過影響水稻光合作用導致的，這一部分機理有待于進一步深入研究。

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Effects of Phosphate Starvation Responses Geneon Growth in Rice

LIU Lu1, XU Chuanshan2, SUN Yafei3, HU Zhi1, AI Hao1, LIU Xiuli1, WANG Xiaowen1,4, SUN Shubin1,*

(1College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Agricultural Bureau of Lanshan District, Linyi City, Linyi 276000, China;3Eco-Environmental Protection Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China;4Landscape Architecture Department, College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: sunshubin@njau.edu.cn)

【】This work aims at confirming the effects of gene, involved in phosphate starvation responses on rice growth so as to reveal its function. 【】The bioinformatics method was used to determine thegene and its protein structure and the-acting elements on thepromoter. The expression ofunder different deficiency conditions was measured by real-time PCR. For an insight into the effects ofon the growth and photosynthesis of transgenic plants, we determined the phenotype, phosphorus content and net photosynthetic rate of DNA insertion mutants and silencing interfering materials at different growth stages. 【】The coding region of thegene is 3548 bp in length and it is located on chromosome 1, with 11 exons and 10 introns. OsSQD2.1 belongs to the glycosyltransferase family;promoter contains multiple reported-acting elements responsive to phosphorus deficiency;was induced by phosphorus deficiency and inhibited by sulfur deficiency. Compared with the wild type, the shoot length and primary root length during the vegetative growth period in the mutant or silencing materials were significantly lower than the wild type. During the reproductive growth, the plant height as well as 1000-grain weight of the mutant or silencing material was significantly lower than that of wild type, and there was no significant difference in seed setting rate; The total phosphorus contents in the leaves were not significantly different in the wild type under the phosphorus deficiency condition. In addition, the net photosynthetic rate of the seedling and mature mutants was significantly lower than that of the wild type, and it was presumed thataffected the net photosynthetic rate of rice. 【】The results confirm thatis phosphorus deficiency-responsive and affects rice growth.

phosphate; phosphate starvation response; phosphorus deficiency; rice; development

Q755; Q945.1

A

1001-7216(2020)03-0237-08

10.16819/j.1001-7216.2020.9074

2019-06-28;

2019-10-22。

國家自然科學基金資助項目(31672226)；轉基因生物新品種培育科技重大專項(2016ZX08009-003-005)。