基于多反應監測質譜技術的水稻葉片蛋白絕對定量方法

陳銘學 楊歡 曹趙云 馬有寧 曹珍珍 程方民

基于多反應監測質譜技術的水稻葉片蛋白絕對定量方法

陳銘學1,2,#楊歡2,#曹趙云2馬有寧2曹珍珍2程方民1,*

(1浙江大學 農業與生物技術學院，杭州 310058；2中國水稻研究所，杭州 310006；#共同第一作者；*通信聯系人，E-mail: chengfm@zju.edu.cn)

【】建立水稻葉片蛋白的多反應監測(MRM)質譜絕對定量方法。水稻葉片蛋白經含1.0%十二烷基硫酸鈉(SDS)的磷酸鹽(PBS)緩沖液提取，丙酮沉淀除雜純化、胰蛋白酶消化，酶解液經液相色譜分離，MRM質譜監測，外標法定量。向提取緩沖液中加入1.0% SDS可增強水稻葉片中16種靶蛋白和總蛋白質的提取效果；不同有機試劑處理，總蛋白質沉淀量存在顯著差異(<0.05)，沉淀能力從強到弱依次為乙腈>丙酮>異丙醇>甲醇>乙醇；對于16種目標蛋白，總體以丙酮沉淀效果最好，其次是異丙醇和乙腈，甲醇和乙醇效果較差。該方法線性范圍均達到3個數量級，定量限為0.1~2.5 nmol/L，灌漿期16種水稻葉片蛋白質含量為6.0~2818.1 μg/g，相對標準偏差均小于14%。SDS可顯著提高水稻葉片蛋白提取效果，采用丙酮或乙腈可獲得較好的蛋白沉淀效果，但不同蛋白質略有差異。結合MRM質譜監測技術可實現水稻葉片蛋白的絕對定量，方法線性范圍寬、敏度高、重復性好。

水稻葉片；蛋白質；多反應監測；SOD法；絕對定量

生物體內蛋白質豐度的動態變化對各種生命過程有著重要影響[1]，準確測定不同狀態下復雜生物體內蛋白質表達量及量的變化，是定量蛋白質組學研究的重要內容[2]。近年來，高分辨率、高掃描速度生物質譜技術的進步，推動了蛋白絕對定量技術的發展。其中，多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)質譜具有選擇性強、靈敏度高、線性寬等技術優勢[3]，被視為靶向蛋白絕對定量的重要手段，并已應用于特異性生物標志物篩的選驗證[4-5]、食物過敏源的痕量檢測[6-7]及植物中重要功能蛋白質的定量分析[8]等領域。

盡管MRM質譜技術具有諸多技術優勢，但研究發現，目標蛋白提取效果、非蛋白組分干擾等因素均會嚴重影響方法準確度和重復性[9]，這給現有的蛋白樣本制備手段帶來巨大挑戰。由于生物基質極為復雜，尤其是植物組織中存在大量蛋白酶、厚壁細胞和次生代謝化合物(如酚類和色素物質等)[10]，嚴重影響蛋白的提取率和質譜分析。現有的植物蛋白質提取方法如酚法、三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)-丙酮沉淀法等均存在蛋白質提取步驟繁瑣，耗時長，沉淀后蛋白復溶不完全等問題[11-12]，難以滿足定量分析的要求。此外，傳統樣品制備過程中的內源共提物和外源變性劑等對質譜的離子碎片采集帶來干擾，進而對方法準確度和精密度造成不利影響[13]。因此，建立高效的蛋白樣品制備方法成為MRM質譜蛋白定量技術的核心內容。

水稻(L.)是最重要的糧食作物之一，準確測定不同生理或病理條件下蛋白質表達量的變化，對于闡明自身防御系統的分子機制，增強作物抗逆能力及提高籽粒產量與品質等具有重要意義[8,14]。截至目前，有關水稻蛋白質的絕對定量技術卻鮮有報道。本研究根據特異性肽段的疏水性、等電點、肽段長度及在色譜中的保留行為等特征，選擇16種典型肽段對應的水稻葉片蛋白為研究對象[15]，采用表面活性劑輔助沉淀/顆粒酶解(surfactant aided precipitation/on pellet digestion, SOD)蛋白提取、有機試劑沉淀除雜等系列技術，建立了適用于水稻葉片蛋白的絕對定量方法。該方法的建立，將為水稻MRM質譜定量蛋白組學研究提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設備與試劑

LC-20ADXR 液相色譜儀(日本島津公司)；AB SCIEX QTRAP 5500質譜儀(美國AB Sciex公司)；Poroshell 120 EC-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm, 美國Agilent公司)；UV-2600紫外分光光度計(日本島津公司)；SD-C18固相萃取小柱(美國3M公司)；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)。

乙腈、甲醇、丙酮、乙醇和異丙醇(德國Merck公司)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)殘留試劑盒、20×PBS緩沖液、牛血清蛋白和BCA蛋白質定量試劑盒(上海Sangon公司)；乙二胺四乙酸、碳酸氫銨(NH4HCO3，Acros Organics公司)；甲酸(美國Fluka公司)；蔗糖(純度≥99%，阿拉丁試劑有限公司)；SDS、碘乙酰胺(iodoacetamide, IAA)、胰蛋白酶、尿素、蛋白酶抑制劑(美國Sigma公司)；3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽{3-[3-(cholamidopropyl)dimethylamino]propanesulfonic acid inner salt, CHAPS}、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT，Promega公司)，以上試劑均為分析純或色譜純。16種特征肽段標準品(純度≥95%)均由上海強耀生物科技公司合成。

1.2 水稻葉片總蛋白質樣品制備及酶解

1.2.1 SOD法

供試水稻品種為9311，于2018年5月10日播種并按大田常規水肥管理，待水稻生長至灌漿期，取劍葉葉片，剪去中脈后置于?80℃冰箱凍藏。稱取0.5 g經液氮研磨后的水稻葉片樣品置于50 mL離心管中，加入5 mL含1.0% SDS的PBS緩沖液(100 mmol/L, pH 7.4)，冰浴中高速勻漿超聲30 s，于4℃、10 000×條件下離心30 min。取上清液分別加入50 μL 1 mol/L DTT使其終濃度為10 mmol/L，于56 ℃條件下反應30 min；加入125 μL 1 mol/L IAA使其終濃度為25 mmol/L，于37 ℃條件下避光孵化30 min。加入等體積(5 mL)的預冷丙酮混勻，再加入5倍體積的預冷丙酮劇烈震蕩，置于?20 ℃條件下靜置3 h。取出于4 ℃、10 000×離心45 min，棄去上清液。加入等體積的丙酮/水混合液(丙酮∶水=6∶1)清洗沉淀一次，離心30 min后棄去上清液在空氣中自然晾干。用1 mL 50 mmol/L NH4HCO3(pH 8.0)充分溶解蛋白質，于4℃、10 000×條件下離心30 min，取上清液采用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。酶解參照Kilambi等[12]的方法。

1.2.2 酚法

參照高歡歡等[15]報道的方法進行。

1.2.3 TCA/丙酮沉淀法

參照Ippoushi等[16]報道的方法進行。

1.3 水稻葉片蛋白質酶解液凈化

按Wisniewski等[17]的方法將上述1.2中3種方法獲得的酶解樣品經SD-C18柱吸附凈化。具體凈化步驟如下：依次用1 mL甲醇、0.5 mL 70%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)和0.5 mL 0.1%甲酸溶液活化平衡SD-C18固相萃取小柱；將酶解液裝載于小柱中，在4 ℃、300×下離心3 min；加入0.5 mL 0.1%甲酸溶液沖洗小柱后，用0.5 mL 70%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)洗脫，并重復洗脫一次。將兩次洗脫液混勻過0.22 μm濾膜后上LC-MS/MS分析。

Fig. 1. Total ion chromatogram of 16 kinds of signature peptides.

1.4 儀器采集條件

液相色譜條件：流動相分別為0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)，洗脫梯度為：0~30 min，5%~90% B；30~35 min，90% B；35~35.1 min, 90%~5% B；35.1 ~40 min，5% B。流速為0.2 mL/min，柱溫為40℃。

質譜條件：電噴霧正離子模式(ESI+)；氣簾氣壓力為25 psi；離子源溫度為500 ℃；Gas1和Gas2的壓力均為30 psi；MRM模式采集。

1.5 數據分析

QTRAP 5500數據分析在Ananlyst 1.6.2軟件處理系統上進行。采用SPSS Statistics 19.0軟件(Chicago, Illinois, USA)進行對數據進行統計分析，統計學顯著性水平為95%(<0.05)，采用OriginPro 8.5(美國OriginLab公司)作圖。

2 結果與分析

2.1 MRM采集方法的建立

MRM定量蛋白的技術核心是對靶標蛋白酶解產生的特異性肽段進行質譜監測，但肽段產生的碎片離子通常比藥物或小分子代謝物更為復雜，需選擇優化合適的離子對和質譜采集參數[18]。為此，實驗取16種特征肽段的單一母液，用50%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)配制成濃度為100.0 μg/L的混合標準溶液。將該溶液引入質譜，利用Skyline軟件對16種特征肽段的質譜參數(去簇電壓、碰撞池出口電壓和入口電壓)進行預測和優化，并獲得相應42組離子對的MRM采集參數。

實驗以0.1%甲酸水溶液和乙腈分別為A相和B相，優化洗脫梯度。結果表明，16種特征肽段均在反相色譜柱上獲得較好的保留和良好的分離效果，且單次運行時間小于30 min(16種特征肽段的總離子流見圖1)。通過連續50次進樣發現，各肽段色譜峰面積的相對標準偏差(RSD)均在10%以內，保留時間RSD均小于1.1%。由此說明，該MRM采集方法具有分離效果好、分析速度快、重復性好等特點，能滿足同時分析16種目標蛋白質的技術要求。

將16種特征肽段單儲備液用5%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)配制成5個不同濃度水平的混合標準溶液，每個濃度標液重復測定3次，外標法定量。分別以16種特征肽段峰面積()對質量濃度(, μg/L)繪制標準曲線。由表1可知，各肽段線性關系良好(相關系數均大于0.99)，線性范圍均達到3個數量級。以信噪比(S/N)分別≥3∶1和≥10∶1計算得到的濃度表示儀器檢出限(limits of detection, LOD)和定量限(limits of quantification, LOQ)。16種特征肽段的儀器LOD和LOQ范圍分別為0.03~0.8 nmol/L和0.1~2.5 nmol/L，可用于水稻葉片中16種功能蛋白質的定量分析。

表1 16種特征肽段的線性方程、相關系數及儀器檢出限與定量限

2.2 蛋白質SOD提取方法的建立

2.2.1 表面活性劑的選擇

表面活性劑可使內源性蛋白質酶抑制劑失效，促進樣品中蛋白質的變性、還原和烷基化，有助于去除影響胰蛋白酶水解和LC-MS分析的小分子雜質(如磷脂)[19]。實驗研究了不同SDS濃度(0%、0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%)對16種目標蛋白質和總蛋白質提取量的影響。結果(圖2)表明，Q0D5P8等13種目標蛋白提取量隨著SDS濃度的增加呈先上升后降低的變化趨勢，在SDS含量為1.0%或2.0%時達到峰值；總蛋白隨著提取液中SDS濃度的增加而提高，但當表面活性濃度大于1.0%時，總蛋白濃度趨于飽和。因此，含1.0%SDS的PBS緩沖液(100 mmol/L, pH 7.4)可獲得較高濃度的蛋白質。

此外，我們還考查了其他表面活性劑對水稻葉片蛋白的提取效果。首先，向PBS提取緩沖液(100 mmol/L, pH 7.4)中加入相同濃度(1.0%)的CHAPS和SDS，并以PBS提取緩沖液為對照，采用已建立的MRM質譜法對16種目標蛋白提取量進行比較。結果表明，使用CHAPS和SDS均有利于促進目標蛋白的提取，但使用后者的效果更好。其中，使用SDS獲得的12種目標蛋白提取濃度顯著高于CHAPS和對照(<0.05)，增幅分別達14.2%~80.7%和23.4%~138.6%，其余4種蛋白提取量則無明顯差異。與上述16種目標蛋白實驗結果類似，對3種提取液獲得的總蛋白考查結果表明，提取液中加入SDS獲得的蛋白總量最高為9.9±0.7 mg/mL，分別較CHAPS和對照高59.6%和83.3%。上述結果表明，SDS是促進水稻葉片蛋白提取的有效手段。

2.2.2 不同種類有機試劑的沉淀效果比較

使用有機試劑不僅可去除粗蛋白中可溶性鹽、脂類、核酸等雜質，也能有效去除提取步驟引入的SDS[20]。蛋白質的沉淀效果不僅受蛋白質種類、分子量的影響，也與沉淀試劑種類密切相關。因此，實驗考查了乙腈、乙醇、丙酮、甲醇和異丙醇5種有機溶劑對蛋白質的沉淀效果和SDS的去除作用。

實驗結果表明，5種有機試劑處理，總蛋白質沉淀量從高到低依次為乙腈>丙酮>異丙醇>甲醇>乙醇(<0.05)。但從圖3可以看出，11種目標蛋白采用丙酮沉淀效果最好，少數(如Q9ZP20、Q0D5P8、Q8H8D6)采用異丙醇或乙腈可獲得最佳沉淀效果。但總體而言，以丙酮效果最好，其次是乙腈和異丙醇，甲醇和乙醇則效果較差。這與不同有機試劑沉淀總蛋白效果略有差異，說明沉淀試劑對蛋白沉淀效果具有一定選擇性。

Bereman等[13]研究表明，過高濃度的SDS會抑制胰蛋白酶活性，干擾RPLC的分離和MS分析。因此，SDS殘留量可作為粗蛋白沉淀除雜的一項重要指標。實驗結果顯示，采用上述5種有機試劑對SDS的去除率均可達94.2%以上，均能保證樣品中SDS濃度低于0.01%，符合HPLC和LC/MS分析條件[21]。綜上，實驗選擇丙酮作為16種目標蛋白的沉淀劑。

圖中數據為均值±標準差（n=3）；不同字母表示在0.05水平上有顯著性差異，而具相同字母表示無顯著性差異。縱坐標為蛋白質相對提取百分比，以未加SDS的提取液對應的各目標蛋白提取量為100%計算。

Fig. 2. Influence of different concentrations of SDS in extraction buffer on the extraction effects of 16 kinds of proteins in rice leaves.

圖中數據為均值±標準差（n=3），不同字母表示在0.05水平上有顯著性差異，而具相同字母表示無顯著性差異。縱坐標為蛋白質相對提取百分比，以乙腈沉淀對應的各目標蛋白提取量為100%計。

Fig. 3. Comparison of precipitation effects of 16 kinds of proteins in rice leaves among five different organic reagents.

圖中數據為均值±標準差（n=3），不同字母表示在0.05水平上有顯著性差異，而具相同字母表示無顯著性差異。縱坐標為蛋白質相對提取量，以酚法對應的各目標蛋白提取量為100%計。

Fig. 4. Comparison of extraction effects of 16 proteins in rice leaves by SOD, phenol and TCA-acetone precipitation methods.

2.2.3 SOD法與酚法、TCA-丙酮沉淀法比較

將已建立的SOD法與傳統酚法和TCA-丙酮沉淀法對16種目標蛋白質和總蛋白的提取效果進行比較(圖4)。由圖4可以看出，采用SOD法對Q40667等9種蛋白的提取量均顯著高于另兩種方法(<0.05)，對應提取量分別比酚法和TCA-丙酮沉淀法高24.7%~96.5%和15.6%~84.7%；TCA-丙酮沉淀法僅對P12085等4種蛋白質的提取量顯著高于SOD法和酚法(<0.05)；相對而言，酚法的提取效果最差。總蛋白提取量顯示，SOD法提取的總蛋白與酚法無顯著差異，但均顯著高于TCA-丙酮沉淀法(<0.05)。綜合考慮，與酚法和TCA-丙酮沉淀法相比，SOD法更適用于水稻葉片中16種重要功能蛋白質定量分析的樣品制備。

2.3 方法應用

按上述1.2.1 SOD法重復制備蛋白質樣品(=6)，采用LC-MS/MS和外標法測定16種水稻葉片蛋白含量。結果如表2所示，灌漿期16種葉片蛋白質的含量范圍在6.0~2818.1 μg/g，相對標準偏差均在13.9%以下。其中，Q69S39含量最高(2818.1±219.9 μg/g)，該蛋白是位于葉綠體類囊體膜上，參與光合作用的細胞色素b6-f復合物重要組分，但還未見對其絕對含量的相關報道。因此，本實驗所建立的SOD法能有效地提取水稻葉片中蛋白質，并結合MRM質譜技術和外標法，實現水稻灌漿期16種葉片蛋白質的絕對定量。

表2 SOD法測定水稻16種葉片蛋白質絕對含量(n=6)

RSD, Relative standard deviation.

3 討論

SDS陰離子變性劑一方面破壞蛋白質的二級和三級結構，提高蛋白質溶解度和酶解，在蛋白質(特別是膜蛋白)測定和蛋白質組的全面表征中有所應用[22]。另一方面，Ilavenil等[23]研究表明濃度過高(>1.0%)時也會抑制胰蛋白酶活性，過量的SDS會產生DS?，抑制離子電離，影響質譜分析結果。實驗對提取液中SDS濃度優化結果發現，SDS濃度在1.0%以內，16種目標蛋白和總蛋白提取量隨濃度增大而增加，但超過1.0%后逐漸趨于飽和甚至呈下降趨勢。該結果與An等[19]研究SDS對血漿中治療蛋白提取效率影響的結果一致。因此，SDS可作為一種通用技術，用于生物組織中蛋白質的提取。

有機試劑一方面能降低溶液的電解常數，導致溶解度下降；另一方面與水作用，破壞蛋白顆粒的水化膜，使大部分蛋白質變性聚集沉淀。實驗研究不同種類有機試劑對水稻葉片蛋白的沉淀效果發現，乙腈、甲醇、丙酮等5種有機試劑對總蛋白和16種目標蛋白沉淀效果存在差異。總蛋白質沉淀量從高到低依次為乙腈>丙酮>異丙醇>甲醇>乙醇，但絕大多數目標蛋白則采用丙酮沉淀可獲得最高豐度，少數(如Q9ZP20、Q0D5P8、Q8H8D6)采用異丙醇或乙腈可獲得最佳沉淀效果。這種現象說明不同沉淀劑對蛋白質具有一定的選擇性。如Ouyang[24]比較多種試劑對血漿中治療蛋白的沉淀效果發現，盡管乙腈沉淀可得到最大蛋白濃度，但甲醇沉淀更利于目標蛋白后續復溶和酶解研究。對于煙曲霉的分泌蛋白而言，氯仿/甲醇沉淀后能獲得最高的蛋白質回收率[25]，但海馬等中藥材中的功能蛋白質在丙酮沉淀下能獲得較為全面的蛋白質表達譜[26]。因此，針對基質背景各異和種類特性不同的蛋白質，需合理選擇有機試劑沉淀以達到高效提取。

此外，丙酮沉淀既能濃縮蛋白，也可以除去粗提液中的可溶性雜質，起到純化蛋白的作用。盡管去垢小柱、FASP和MOFs材料等方法被用于去除樣品中殘留的SDS，但存在成本高，操作步驟繁瑣等問題。Santa等[20]采用丙酮沉淀去除提取液中SDS，有效避免殘留SDS對酶解和定量分析的干擾，提高了蛋白質的回收率和重現性。

復雜組分共存干擾物和待測蛋白豐度差異大，一直是影響生物體中蛋白準確定量的關鍵因素。盡管人們嘗試多種方法，如提高混合組分分離，去除干擾物等，但對低豐度蛋白質的檢測靈敏度和精密度仍不能滿足分析的要求。MRM質譜技術則通過特征肽段離子對的選擇性監測，降低了復雜組分的背景信號干擾，從而提高了對低豐度靶標蛋白的分析靈敏度，延伸了定量的動態范圍。如Rezeli等[27]采用MRM技術對人體血漿中87個心血管等疾病相關蛋白標志物進行定量檢測，最大線性動態范圍達4到5個數量級，定量結果精密度RSD小于4.7%。此外，Hoofnagle等[28]從方法驗證學上，對MRM技術和傳統的免疫分析法進行系統比較，結果發現，兩者的分析結果相關性達到0.61~0.96，并提出MRM技術可作為傳統蛋白定量的替代技術，具有很大的應用價值。本研究結果表明，盡管樣品基質較為復雜，但16種目標蛋白的線性范圍仍超過2個數量級。此外，雖實際樣品中各蛋白豐度差異也非常大(各蛋白含量水平為6.0~2818.1 μg/g)，但仍可獲得良好的重復性，即各蛋白的分析精密度均小于13.9%。

目前基于MRM質譜技術的蛋白定量方法主要應用于動物組織或細胞中蛋白標志物分析，在植物蛋白組學研究應用較少，其原因主要是缺乏標準化操作流程。此外，該技術需要較高的專業技能、分析成本等也是阻礙其快速發展的重要因素。本研究以水稻葉片中相關蛋白為研究對象，采用SOD蛋白制備方法和MRM質譜分析技術，建立一種通用的目標蛋白絕對定量技術流程，以期促進該分析技術在植物蛋白組學中的推廣和運用。

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Absolute Quantification of Proteins in Rice Leaf Based on Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry

CHEN Mingxue1,2,#, YANG Huan2,#, CAO Zhaoyun2, MA Youning2, CAO Zhenzhen2, CHENG Fangmin1,*

(College of Agriculture and Biotechnology,,,;China National Rice Research Institute,,;These authors contributed equally to this work;Corresponding author,:)

【】An absolute quantitative method for proteins in rice leaf based on multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry was established.【】The proteins in rice leaf were extracted with PBS buffer containing 1.0% sodium dodecyl sulfate(SDS), purified by acetone precipitation, and then digested by Trypsin. The enzymatic hydrolysate was separated by liquid chromatography, monitored by MRM mass spectrometry and quantified by external standard method.【】The addition of 1.0% SDS to the extraction buffer enhanced the extraction effect of 16 kinds of target proteins and total proteins in rice leaf. Total proteins precipitation with several solvents varied significantly (<0.05), and the precipitation ability from strong to weak was acetonitrile>acetone>isopropanol>methanol>ethanol. Acetone performed best in the precipitation effect of 16 kinds of target proteins, followed by isopropanol and acetonitrile, and methanol and ethanol represented the worst precipitants. The relative standard deviations of the method were all less than 14% in three orders of magnitude range, with the quantification limit from 0.1 to 2.5 nmol/L, and the contents of 16 kinds of proteins in rice leaf during the grain filling stage ranged from 6.0 to 2818.1 μg/g.【】SDS could significantly improve the extraction effect of proteins in rice leaf. Acetone and acetonitrile addition generated excellent precipitation effects of proteins, with slight difference in various proteins. Combined with MRM mass spectrometry technology, the absolute quantification method for proteins in rice leaf is featured by wide-linear range, high sensitivity and good repeatability.

rice leaf; protein; multiple reaction monitoring; SOD method; absolute quantification

S511.01

A

1001-7216(2020)03-0278-09

10.16819/j.1001-7216.2020.9056

2019-05-15；

2019-08-01。

國家自然科學基金資助項目（31701408）；國家水稻產業體系資助項目（CARS-01-47）；中國農業科學院農業科技創新工程資助項目（CAAS- ZDRW202011）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（Y2019PT19-01）。