接種外源微生物對(duì)堆肥中重金屬銅鋅鉛形態(tài)變化的影響

郝麗娜 常瑞雪 李彥明 汪 杰 陳 清 趙恒宇

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院/農(nóng)田土壤污染防控與修復(fù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

堆肥化處理是有機(jī)固體廢物在多種微生物作用下將原料中不穩(wěn)定有機(jī)類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定腐殖質(zhì)類物質(zhì)的過(guò)程，也是當(dāng)前我國(guó)養(yǎng)殖糞污綜合利用所采用的主要技術(shù)途徑[1-2]，其中殘留的重金屬已成為限制畜禽糞便肥料化循環(huán)安全利用的主要因素[3]。殘留重金屬有機(jī)固體廢棄物經(jīng)堆肥后，由于有機(jī)物質(zhì)大量降解而導(dǎo)致重金屬相對(duì)濃縮[4-5]，但作物對(duì)堆肥產(chǎn)品中重金屬的吸收比例顯著降低[6-7]。為強(qiáng)化堆肥過(guò)程對(duì)重金屬的鈍化作用，利用外源物質(zhì)降低堆肥重金屬有效性是當(dāng)前的研究熱點(diǎn),如生物炭和粉煤灰等[8-9]。

堆肥接種劑和功能微生物肥料是我國(guó)當(dāng)前發(fā)展迅速的一個(gè)領(lǐng)域。在堆肥過(guò)程中添加微生物菌劑多集中在促進(jìn)有機(jī)物快速降解、加快堆肥進(jìn)程和抗病方面，其中涉及到微生物種類主要由木霉屬、芽孢桿菌屬和酵母屬[10]。木霉屬微生物通常被用作拮抗病原菌的功能菌，比如接種木霉可以有效延長(zhǎng)牛糞堆肥的高溫期和減少氮素?fù)p失，還可拮抗辣椒疫霉[11-12]。用于堆肥的芽孢桿菌屬微生物多屬于嗜熱菌，是高溫好氧堆肥中的優(yōu)勢(shì)菌，比如解淀粉芽孢桿菌可高效分解堆肥原料中的難降解的乙基纖維素，促進(jìn)堆肥升溫，其堆肥產(chǎn)品還可防控草莓土傳病害[13-14]。酵母菌通常由于其發(fā)酵作用被添加在EM菌劑、VT菌劑等接種劑中，酵母菌群在堆肥中可以促進(jìn)堆肥發(fā)酵，還可以合成生物活性物質(zhì)，從而為其他的菌群提供養(yǎng)分[15]。在污水體系中，Siddiquee等[16]研究發(fā)現(xiàn)木霉對(duì)Cu和Pb具有很好的耐受性，并且具有很好的吸收能力，Allievi等[17]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的表層蛋白可以對(duì)Zn產(chǎn)生吸附作用，Machado等[18]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母活細(xì)胞和死細(xì)胞的形態(tài)及表面官能團(tuán)沒(méi)有明顯變化，死細(xì)胞仍然對(duì)Cu有很好的吸附效果。但是目前在堆肥體系中微生物對(duì)重金屬作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，此方向具有很好的研究?jī)r(jià)值。本研究依據(jù)前人的研究，采用室內(nèi)模擬堆肥試驗(yàn)的方法，探究接種外源微生物長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)對(duì)堆肥重金屬銅鋅鉛形態(tài)的影響，旨在為優(yōu)化堆肥工藝和畜禽糞便安全利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

堆肥試驗(yàn)所用的豬糞取自北京市昌平區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)，玉米秸稈取自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗(yàn)站，經(jīng)自然風(fēng)干后粉碎至1 cm以下備用，供試豬糞與玉米秸稈的理化性狀如表1所示；所用的微生物菌劑長(zhǎng)枝木霉和解淀粉芽孢桿菌由山東金正大生態(tài)工程股份有限公司提供，釀酒酵母為市售食品級(jí)粉狀菌劑(由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn))。

表1 供試豬糞與玉米秸稈的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of swine manure and maize straw

1.2 試驗(yàn)操作與樣品采集

按照混合物料初始含水率60%左右和碳氮比25左右的要求，將6 kg豬糞和2 kg玉米秸稈和2.4 L水混合均勻后平均分4份，設(shè)置不接種外源微生物的對(duì)照處理(CK)和按照濕重比5‰分別接種長(zhǎng)枝木霉(T1)、解淀粉芽孢桿菌(T2)和釀酒酵母(T3)處理，同時(shí)采集混合物料的樣品以備后續(xù)測(cè)定。將所有處理充分混合均勻等重加入8 L堆肥發(fā)酵罐，連接好堆肥反應(yīng)器系統(tǒng)的傳感器和管路，堆肥發(fā)酵罐底部和頂部分別置有進(jìn)氣口和出氣口，均與硅膠管相連。進(jìn)氣口與氣泵相連，對(duì)混合物料進(jìn)行曝氣，以保證整個(gè)過(guò)程處于好氧反應(yīng)，每個(gè)發(fā)酵罐曝氣量由轉(zhuǎn)子流量計(jì)控制，調(diào)節(jié)曝氣量為200 mL/min。進(jìn)氣口連接NaOH和硼酸溶液的吸收瓶，出氣口分別連接2%硼酸溶液和1 moL/L NaOH吸收瓶。整個(gè)堆肥反應(yīng)器系統(tǒng)的構(gòu)成如圖1所示。

之后分別在第3、7、12、19和26 d進(jìn)行翻堆取樣，樣品采集采用多點(diǎn)采樣法收集樣品，然后用四分法取樣，每次采集2份樣品，一份立即進(jìn)行冷凍處理(<-18 ℃)，用于測(cè)定pH、發(fā)芽指數(shù)(GI值)等指標(biāo)；另一份經(jīng)自然風(fēng)干后，粉碎至100目備用，用于測(cè)定物料全碳、重金屬總量和形態(tài)等指標(biāo)。

圖1 堆肥裝置示意圖
Fig.1 Schematic diagram of compost plant

1.3 分析方法

溫度傳感器為Pt-100，采集頻率為每1 h記錄1次數(shù)據(jù)；CO2累積量采用氫氧化鈉吸收法，吸收液由0.1 moL/L的稀硫酸溶液滴定；物料有機(jī)質(zhì)含量采用灼燒法測(cè)定[19]；GI值測(cè)定如下：稱取10 g鮮樣于250 mL塑料瓶中，按照固液比為1∶10，加 100 mL 去離子水，在恒溫?fù)u床上(25 ℃和200 r/min)震蕩30 min，過(guò)濾得到浸提液，然后吸取5 mL于墊有定量濾紙的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，均勻的撒10個(gè)水蘿卜種子，在避光和25 ℃的條件下培養(yǎng) 48 h 后測(cè)定，以加去離子水的培養(yǎng)為對(duì)照。GI(%)參照如下計(jì)算公式計(jì)算：

重金屬總量采用王水提取法提取消解，重金屬形態(tài)采用改進(jìn)的BCR連續(xù)提取法[20]，主要包含可交換態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)。重金屬含量使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測(cè)定。重金屬相關(guān)計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)堆肥理化性質(zhì)的影響

在堆肥過(guò)程中，微生物降解有機(jī)物會(huì)伴隨熱量產(chǎn)生，因此堆體溫度的高低與微生物的新陳代謝作用密切相關(guān)[10]。由圖2(a)可知，4個(gè)處理溫度達(dá)到60 ℃以上的時(shí)間分別是第4、1、1和3天，即接種外源微生物有效縮短了堆體進(jìn)入高溫期的時(shí)間，且接種長(zhǎng)枝木霉或解淀粉芽孢桿菌縮短了3 d，接種釀酒酵母可縮短1 d。《GB 7959—2012糞便無(wú)害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[21]中規(guī)定畜禽糞便堆肥溫度在50～55 ℃以上持續(xù)5～7 d即可達(dá)到無(wú)害化，本試驗(yàn)4個(gè)堆肥處理 55 ℃ 以上高溫期分別為12、13、13和18 d，均已達(dá)到無(wú)害化標(biāo)準(zhǔn)，且在堆肥中接種微生物延長(zhǎng)了高溫期。在微生物降解堆肥有機(jī)質(zhì)的過(guò)程中會(huì)利用環(huán)境中的O2，釋放CO2和水。由圖2(b)可知，堆肥第2～13天為CO2釋放的高峰期，這也與堆肥溫度變化趨勢(shì)大致相同。由圖2(c)可知，各堆肥處理的有機(jī)質(zhì)含量均隨堆肥時(shí)間推移逐漸減少，CK、T1、T2和T3處理的有機(jī)質(zhì)含量較各自初始值分別減少了11.16%、15.38%、18.23%和15.15%，即T2中添加解淀粉芽孢桿菌后更利于有機(jī)質(zhì)的降解。由圖2(d)可知，接種微生物的處理GI值均在堆肥 12 d 率先超過(guò)80%，CK處理在第26天超過(guò)80%，表明接種長(zhǎng)枝木霉和解淀粉芽孢桿菌比對(duì)照提前14 d實(shí)現(xiàn)堆肥腐熟。在堆肥26 d結(jié)束時(shí)，各處理的GI值為92.11%～107.63%，排序?yàn)門3>T2≈T1≈CK，表明堆肥腐熟度極高。

2.2 銅(Cu)的形態(tài)變化

由圖3(a)可知，各處理的可還原態(tài)Cu分配率由堆肥前的38.19%分別降至11.86%、10.00%、4.98%和11.04%；相對(duì)應(yīng)的Cu可氧化態(tài)分配率由堆肥前的30.79%增為65.39%、59.05%、75.73%和60.17%，這表明堆肥后Cu向更穩(wěn)定的形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變。將Cu可交換態(tài)和可還原態(tài)分配率加和為有效態(tài)來(lái)看，由圖3(b)可知，有效態(tài)相對(duì)鈍化率為T2(80.96%)>T1(67.46%)>T3(64.08%)>CK (63.61%)，這表明與對(duì)照相比，接種微生物可以使得Cu的有效性進(jìn)一步降低，且解淀粉芽孢桿菌鈍化效果>長(zhǎng)枝木霉>釀酒酵母。

2.3 鋅(Zn)的形態(tài)變化

由圖4(a)可知，Zn在堆肥前后均以可交換態(tài)和可還原態(tài)為主，二者之和占比達(dá)75.87%～81.51%，而可氧化態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)占比較低，表明堆肥中Zn的有效性較高。經(jīng)過(guò)堆肥后各處理Zn可交換態(tài)分配率變化較為明顯，從堆肥前的25.30%分別降至11.27%、10.81%、9.26%和9.54%，從Zn的可交換態(tài)相對(duì)鈍化率來(lái)看，T2(63.38%)>T3(62.28%)>T1(57.27%)>CK(55.45%)。由圖4(b)可知，將Zn可交換態(tài)和可還原態(tài)分配率之和作為有效態(tài)來(lái)比較相對(duì)鈍化率，T2(5.02%)>T3(0.10%)>T1(-0.30%)>CK(-2.05%)，這表明較對(duì)照而言，在堆肥中接種解淀粉芽孢桿菌和釀酒酵母可以進(jìn)一步降低Zn的有效性。

圖2 溫度(a)、CO2累積排放量(b)、有機(jī)質(zhì)含量(c)、GI(d)變化
Fig.2 Changes of composting temperature (a), cumulative CO2emissions (b), Organic matter (c) and GI (d)

圖3 堆肥前后Cu各形態(tài)變化(a)及相對(duì)鈍化率(b)
Fig.3 Cu morphology changes before and after compost (a), relative passivation rate of Cu after compost(b)

2.4 鉛(Pb)的形態(tài)變化

由圖5(a)可知，與對(duì)照相比，接種長(zhǎng)枝木霉后可氧化態(tài)分配率提高了30.49%，接種解淀粉芽孢桿菌堆肥后可還原態(tài)Pb分配率降低了40.89%，接種釀酒酵母后Pb殘?jiān)鼞B(tài)分配率提高了56.00%。由圖5(b)可知將Pb可交換態(tài)和可還原態(tài)分配率之和作為有效態(tài)來(lái)比較Pb的相對(duì)鈍化率，可以得出：T2(41.00%)>T3(11.51%)>T1(5.01%)>CK(2.54%)，這表明與對(duì)照相比，接種微生物可以進(jìn)一步降低Pb的有效性，并且接種解淀粉芽孢桿菌的效果最佳。

3 討 論

重金屬的可交換態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)這四種形態(tài)的有效性依次降低，因此本研究主要通過(guò)對(duì)比堆肥前后可交換態(tài)和可還原態(tài)分配率變化來(lái)判斷重金屬鈍化效果[22]。由圖2溫度、CO2累積排放量、有機(jī)質(zhì)含量和GI值數(shù)據(jù)可知，在豬糞和玉米秸稈的堆肥中分別接種長(zhǎng)枝木霉、解淀粉芽孢桿菌、釀酒酵母后加速了堆體升溫、促進(jìn)了有機(jī)質(zhì)的降解并且加快了堆肥腐熟，這是因?yàn)榻臃N外源微生物后提高了堆肥體系中微生物的活性，優(yōu)化了微生物的種群結(jié)構(gòu)[23]，且綜合作用效果解淀粉芽孢桿菌>長(zhǎng)枝木霉>釀酒酵母，這也與重金屬銅鋅的鈍化效果一致，加入解淀粉芽孢桿菌的處理對(duì)銅鋅鉛的形態(tài)變化均表現(xiàn)出明顯效果，加入長(zhǎng)枝木霉和釀酒酵母對(duì)銅鋅鉛的作用效果雖不及解淀粉芽孢桿菌，但也優(yōu)于對(duì)照組。因此，堆肥體系中微生物的活性高低可能會(huì)與重金屬的鈍化有很大關(guān)聯(lián)。

圖4 堆肥前后Zn各形態(tài)變化(a)及相對(duì)鈍化率(b)
Fig.4 Zn morphology changes before and after compost (a) and relative passivation rate of Zn after compost (b)

圖5 堆肥前后Pb各形態(tài)變化(a)及相對(duì)鈍化率(b)
Fig.5 Pb morphology changes before and after compost (a) and relative passivation rate of Pb after compost (b)

這是由于微生物細(xì)胞壁表面的脂多糖、肽聚糖、膜蛋白、脂磷壁酸和磷壁酸等結(jié)構(gòu)使得其具有了羧基、羥基、氨基、磷基和硫基等官能團(tuán)[24-25]。微生物細(xì)胞表面的羧基和羥基等活性官能團(tuán)上的N、O和S等原子利用孤對(duì)電子與Cu2+、Zn2+和Pb2+發(fā)生配位發(fā)生絡(luò)合和鰲合反應(yīng)[26-28]，另外細(xì)胞壁表面的硫基和磷酸基可以和重金屬離子結(jié)合形成沉淀[29]，并且這種微生物產(chǎn)生的化學(xué)作用不會(huì)隨著微生物的凋亡而結(jié)束，細(xì)胞凋亡后微生物細(xì)胞壁表面的官能團(tuán)也不會(huì)被破壞。Carrie等[30]指出木霉可以利用氨基、硫基、羰基與Cu和Pb發(fā)生絡(luò)合、鰲合反應(yīng)，Allievi等[17]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌表層蛋白對(duì)Zn2+有很好的吸附作用，Machado等[18]指出釀酒酵母對(duì)Cu有很好的絡(luò)合作用。這均與本研究結(jié)果一致，長(zhǎng)枝木霉對(duì)Cu和Pb有較好的鈍化作用，解淀粉芽孢桿菌對(duì)Zn表現(xiàn)出很好的鈍化作用，釀酒酵母對(duì)Cu的鈍化效果較好。另外，微生物生命活動(dòng)過(guò)程中會(huì)分泌胞外聚合物，這些物質(zhì)也是大分子的蛋白質(zhì)多糖化合物，可以和重金屬離子發(fā)生絡(luò)合、鰲合反應(yīng)[31]。也有研究指出生防芽孢桿菌可以分泌鐵鰲合酶，而這種鐵鰲合酶也可以結(jié)合Zn2+[32]，這也可能是本研究中解淀粉芽孢桿菌對(duì)Zn有較好鈍化效果的原因。

但是由于微生物的生命活動(dòng)和細(xì)胞的降解，微生物對(duì)重金屬產(chǎn)生的作用僅是相對(duì)的鈍化，并非絕對(duì)鈍化，待有機(jī)肥施用到土壤中，經(jīng)歷漫長(zhǎng)歲月后重金屬是否依然被固定，這值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

1)在豬糞和玉米秸稈堆肥體系中在接種外源微生物對(duì)堆肥理化性質(zhì)有了明顯改善。首先接種外源微生物可提前3、3、1 d使堆肥溫度上升至60 ℃并延長(zhǎng)高溫期；其次接種微生物后堆肥體系中有機(jī)質(zhì)的降解量明顯加大；另外接種長(zhǎng)枝木霉和解淀粉芽孢桿菌還明顯縮短了腐熟過(guò)程。

2)添加外源微生物后明顯降低了重金屬Cu、Zn和Pb的有效性。3種微生物中，解淀粉芽孢桿菌對(duì)Cu、Zn和Pb的有效性降低效果都較好。相對(duì)鈍化率分別為80.96%、5.02%和41.00%；長(zhǎng)枝木霉對(duì)Cu和Pd的有效性降低效果較好，相對(duì)鈍化率分別為67.09%和5.01%；釀酒酵母對(duì)Cu和Pb的有效性降低效果較好，相對(duì)鈍化率分別為64.46%和11.51%。因此可以針對(duì)不同需求選擇微生物。