高通量測序分析不同地區紅腐乳細菌多樣性

徐 瓊，劉 洋,，曲勤鳳，竇同海，陳羽菲，張娜娜，趙 磊，鐘 江，翁史昱，楊捷琳，趙國屏

（1.上海市質量監督檢驗技術研究院，上海 200233；2.復旦大學生命科學學院，上海 200433；3.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135）

腐乳是我國傳統的發酵豆制品，至今已有一千多年的生產歷史。它是用豆漿的凝乳狀物經微生物發酵所制成的一種干酪型產品，故又被譽為“中國干酪”[1]。經微生物發酵后的腐乳除大豆本身所具有較高蛋白質、脂肪和大豆異黃酮[2]等營養外，還具有抗氧化[3-4]、抗高血壓[5]、抗乙酰膽堿酯酶活性[6]等生理功能，深受人們的喜愛。

由于腐乳是半開放式生產，且大多為傳統的手工操作，未有加熱殺菌的過程，因此有可能被環境中的微生物雜菌污染[7]，從而影響產品的品質，甚至給消費者的安全帶來隱患。如腐乳中常見的生物胺，主要是由微生物對游離氨基酸的脫羧作用產生[8]，諸如芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭菌屬（Clostridium）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）均能產生脫羧酶[9-10]。此外，氨基甲酸乙酯[11]、腸毒素[12]、丙烯酰胺[13]也是常見的發酵過程中的微生物產生的副產物。

廖新浴等[14]利用純培養和16S rDNA測序相結合對不同類型腐乳優勢菌群進行了研究，發現不同腐乳中的菌群結構各不相同，同時存在優勢的食源性致病菌如蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。由于該結果依賴于純培養，對于含量較低和非可培養微生物可能有所遺漏，無法對樣品中的所有微生物群落進行全面分析。

近年來，隨著測序技術的不斷發展，高通量測序技術也被稱為下一代測序技術，由于成本低、可讀量和質量高，是目前評估微生物多樣性的有力工具[15-16]。許多研究已經將該技術用于發酵食品中菌群多樣性的分析，如豆豉[17]、豆汁[18]、大醬[19]、曲拉[20]等，但運用高通量測序技術分析華東、華北和東北地區腐乳菌群多樣性的研究鮮見報道。

本研究以我國不同地區紅腐乳為研究對象，采用高通量測序技術對細菌16S rDNA V1-V3區進行測序，以期更加全面地了解不同地域紅腐乳中細菌菌群多樣性，明確各自的優勢菌群，為建立地域性特色發酵食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅腐乳樣品從我國6 個省市當地超市購買，每例樣品來源于不同生產廠家，共計9 例，具體地區與樣品情況見表1。

表1 樣品信息Table 1 Information about the samples tested in this study

聚合酶鏈式以應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix（M7505） 美國Promega公司；膠回收試劑盒（Code No. 9762）、引物 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

SW22振蕩水浴槽 德國Julabo公司；Centrifuge 5417R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Nanodrop2000超微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司；VERITI梯度PCR儀 美國ABI公司；Sub-Cell電泳儀、Geldoc XR+型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[21]并稍作修改。取同批次樣品3 份，從每份樣品中倒取50 mL腐乳湯汁，共計150 mL。混合后，取混合樣品湯汁5 mL，9 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀中加入10 mL的無菌水，在振蕩器上振蕩混勻，9 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀加入800 μL溶菌酶（10 mg/mL），37 ℃水浴1 h；然后加入40 μL的蛋白酶K和CTAB裂解液，56 ℃水浴2 h。每管裂解液中加入等量Tris飽和酚-三氯甲烷-異戊醇（25∶24∶1，V/V），混勻，13 000 r/min離心10 min。取上清液至新離心管中，加入等體積三氯甲烷-異戊醇（24∶1，V/V），混勻，13 000 r/min離心10 min。上清液移至新離心管中，加入2 倍體積無水冰乙醇，混勻，靜置30 min左右，13 000 r/min離心2 min。棄上清液，用70%乙醇溶液洗滌沉淀2～3 次，得到的沉淀放置于室溫條件下進行自然風干。風干后加入50 μL Tris-乙二胺四乙酸緩沖液，溶解沉淀。

1.3.2 PCR擴增及16S rRNA測序

以提取的總細菌基因組D N A為模板，引物針對16S rRNA基因V1-V3區合成特異引物，利用27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和534R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）引物進行PCR擴增。PCR體系：基因組模板DNA 2 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，正以引物各0.5 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s；72 ℃延伸45 s，擴增40 個循環；4 ℃保存。對所得的PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對符合要求的PCR產物進行后續實驗。擴增后的PCR產物經純化回收后，使用Illumina MiSeq平臺進行高通量測序及生物信息學分析。

1.4 數據處理

高通量測序得到的雙端序列數據使用FASTQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）進行質量控制。Raw data上的接頭使用CUTADAPT（http://code.google.com/p/cutadapt/）去除。然后使用FLASH（https://sourceforge.net/projects/fl ashpage/ fi les/）連接Pair-end兩端Reads。使用QIIME[22]篩選序列和嵌合體，嵌合體去除使用QIIME的Usearch[23]算法，參數默認。

基于可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析結果，研究環境中微生物的多樣性，使用QIIME分析流程中pick_open_reference方式進行OTU聚類。聚類算法使用Uclust[23]，數據庫使用Greengenes 2013-08 release（http://greengenes.lbl.gov/Download/）版本，相似度閾值為97%，對所有序列進行OTU劃分并進行生物信息統計分析，其余參數為QIIME默認參數。根據樣本分析所得OTU情況使用QIIMEα_diversity分析模塊進行α多樣性分析，其中菌群豐度可由Chao 1指數進行評估，其數值越高表明群落物種豐富度越高；菌群多樣性由Shannon指數、Simpson指數進行評估，Shannon指數與群落多樣性呈正相關，與Simpson指數呈負相關。Coverage指數是測序深度指標，代表每個樣品文庫的覆蓋率。

使用β多樣性分析進行不同樣品在微生物群落構成上的比較。使用軟件QIIMEβ_diversity_through_plots,jackknifed_β_diversity模塊進行β多樣性分析。在之前分析步驟中，已經將序列按照其堿基組成的相似性，劃歸到各個OTU中。在進行分類學分析時，首先，將每一條典型序列都與Greengenes 2013-08 release（http://greengenes.lbl.gov/Download/）數據庫進行比對，找出其最相近且可信度達80%以上的種屬信息，以獲得每個OTU的分類學信息。根據物種注釋，統計每個樣品在分類水平上的序列數目，分類水平分別是門水平（將相對豐度＜0.1%及unidentified歸入others）和屬水平（相對豐度＜5%及unidentified歸入others）。使用軟件QIIME，算法為rdp_classifier[24]v2.2。熱圖使用R語言的“pheatmap”包繪制?；诰褐gUnifrac[25]算法加權的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）可以實現多個樣品的分類。

2 結果與分析

2.1 細菌α多樣性分析

α多樣性以映樣品內部微生物群落的物種豐富度，根據97%相似性水平下的OTU信息，采用α多樣性指標的Shannon指數、Simpson指數和Chao 1指數對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估，結果見表2。所有樣本的測序Coverage指數大于0.9，說明腐乳樣品文庫種序列基本都被測出，未被測到的概率較低，測序結果可以以映樣品真實情況。由表2可知，東北地區樣品（R7和R8）的Chao 1指數和Simpson指數均低于其他樣品，說明該地區紅腐乳樣品中細菌群落豐度和群落多樣性較低，與其他地區存在一定差異。

表2 紅腐乳樣品中細菌α多樣性Table 2 α-Diversity of bacteria present in red sufu samples

采用對測序序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們所能代表OTU數目構建曲線，即稀釋性曲線。當曲線趨于平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量對發現新OTU的邊際貢獻很小；以之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU。因此，通過作稀釋性曲線，可以得出樣品的測序深度情況。由圖1可知，多數樣本在序列數在接近10 000時，OTU已經接近飽和，再增加測序量對于發現新OTU的邊際貢獻很小。說明測序數據量合理，所含菌種數較多?，F有測序量已經可以以映樣品中細菌豐度信息。

圖1 各樣品中細菌稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of bacteria in samples

2.2 細菌群落結構差異性分析

圖2 門水平下紅腐乳樣品中細菌群落結構分布Fig. 2 Distribution of bacterial communities in red sufu samples at phylum level

由圖2可知，紅腐乳中主要細菌優勢門分別為：平均相對豐度為73.93%的厚壁菌門（Firmicutes）、15.12%的放線菌門（Actinobacteria）以及9.63%的變形菌門（Proteobacteria）。不同地區紅腐乳中細菌主要優勢菌群基本相同，但是相對豐度差異較大，即樣品R2和R8中放線菌門的相對豐度分別為42.21%和44.96%，而樣品R9的放線菌門相對豐度只有2.34%；R1中變形菌門的相對豐度是所有紅腐乳中最高的，達到31.63%。說明在門水平下，不同地區紅腐乳中細菌群落結構組成相同，僅組成比例存在一定差異。其中厚壁菌門是不同地區紅腐乳中的絕對優勢菌群。

在屬水平下，9 個紅腐乳樣品共檢測出296 個細菌屬，圖3顯示相對豐度前12的物種。其中共有的菌屬分別為：棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、四聯球菌屬（Tetragenococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、Rummeliibacillus、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、鏈球菌屬（Streptococcus）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）以及Trabulsiella。

圖3 屬水平下紅腐乳樣品中細菌群落結構分布Fig. 3 Distribution of bacterial communities in red sufu samples at genus level

從群落結構分布圖可以發現不同樣品中優勢菌在種類及相對分布上有較大的差異。同一地區的樣品間細菌群落組成相似：R3、R5和R6樣品中優勢屬為明串珠菌屬（29.45%、36.86%、30.72%）、乳球菌屬（9.59%、12.55%、20.72%）以及四聯球菌屬（8.75%、11.36%、12.05%）；R4樣品在豐度上與上述樣品有所差異，分別對應明串珠菌屬（13.33%）、乳球菌屬（10.81%）、四聯球菌屬（47.11%）；而同樣來自華東地區的樣品R1，則展現了不同的細菌群落組成，相對豐度為22.83%的叢毛單胞菌屬是該樣品的優勢菌屬，這個屬在其他樣品中的相對豐度均小于2%。叢毛單胞菌屬在1985年由De Vos等[26]建立，該屬中的菌株更多地與環境污染物的降解有關[27-28]，在食品中鮮有報道。因此在食品發酵中對于該菌屬的認識值得深入研究。

此外，樣品R5、R6中的魏斯氏菌屬（5.55%、4.03%）是相比于其他樣品所特有的菌屬。芽孢桿菌屬和鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）主要出現在R7、R8和R9樣品中，芽孢桿菌屬為R7和R9的優勢菌，相對豐度分別為58.08%和52.24%。華東地區的優勢菌屬明串珠菌屬在R7、R8和R9中相對豐度較低，均低于5%。R8中棒狀桿菌屬（44.08%）是該樣品的優勢菌屬。相比于其他樣品，R8中梭菌屬（Clostridium）相對豐度最高，達到7.12%。梭菌屬是能形成芽孢、厭氧生長的革蘭氏染色陽性大桿菌，可以分解糖、蛋白質，通常可以產生混合的有機酸和醇類，不還原硫酸鹽。它們的代謝物極富多樣性，廣泛分布在環境中，許多種可產生外毒素危害人類和牲畜生命健康[29]。

2.3 細菌β多樣性分析

根據OTU的豐度數據，熱圖可在屬水平上將不同的OTU分塊聚類，并根據顏色梯度以映不同樣品中細菌群落相似性、差異性及物種聚類關系。利用R語言繪制熱圖，可以直觀地顯示不同地區樣品中微生物的差異。由圖4可知，上側為樣品聚類樹，左側為OTU聚類樹，不同地區的9 種紅腐乳可分為3 個聚類：R7、R8和R9聚為一類，R3、R4、R5和R6聚為一類，R1和R2聚為一類，說明不同樣品間細菌群落存在一定的差異性。

圖4 樣品中不同屬組成和相對豐度的熱圖Fig. 4 Heatmap of composition and relative abundance of different genera

圖5 不同地區腐乳樣品中細菌群落主成分分析Fig. 5 Principal coordinate analysis of bacterial communities in red sufu samples

基于UniFrac距離的加權主坐標法對9 種紅腐乳細菌群落結構進行分析。如圖5所示，細菌群落第1主成分（PC1）貢獻率為52.36%，第2主成分（PC2）貢獻率為22.77%。兩主成分之和大于70%，表明2 個成分較好地代表了樣品中的細菌群落信息。從圖5可知，不同腐乳樣本中的菌群與地理位置存在一定關系，同一地區的紅腐乳樣品具有一定的聚類趨勢，這與熱圖樣品聚類結果相似：R3、R4、R5和R6聚為一類，均來源于華東地區；樣品R7（東北）和R9（華北）聚為一類；R1（華東）、R2（華北）、R8（東北）3 個樣品較為離散，各自獨立。

3 討 論

腐乳是中國獨具特色的大豆發酵食品之一，大豆經微生物發酵后所制成的一種干酪型產品[30]。通常根據其色澤風味可分為白腐乳、紅腐乳、青（臭）腐乳三大類[31]。紅腐乳添加紅曲浸潤數月后釀制而成，故表面呈自然紅色。腐乳風味的形成主要取決于微生物的發酵，腐乳中微生物群落特征的差異是不同地區風味不同的重要原因之一。有學者對紅腐乳中的紅曲霉進行遺傳學比較，發現不同地區的紅曲霉存在一定的遺傳差異性[32]。由于腐乳特殊的生產工藝以及未有加熱殺菌的過程，使得腐乳中微生物種類和數量受到廣大學者的關注。因此對腐乳中微生物菌群的分析研究有助于為產品質量控制、挖掘潛在功能性微生物及風味改良提供理論支持。目前對于腐乳中微生物菌群的研究主要分為培養法和非培養法兩種。利用傳統微生物分離培養法，紅腐乳中主要的優勢菌種為蠟狀芽孢桿菌和Virgibacillus senegalensis[14]；植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳桿菌Akporo7和嗜鹽乳桿菌[33]也被發現存在于腐乳中。周婷婷等[34]分析了不同品牌白腐乳樣品的蠟樣芽孢桿菌總數，其中有2 個樣品的蠟樣芽孢桿菌數達到106CFU/g。Han等[31]對3 種類型腐乳中的不同微生物進行了鑒定和計數，發現腐乳中致病菌有蠟樣芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌。值得注意的是，由于樣品中存在大量的芽孢菌，干擾了金黃色葡萄球菌在選擇性平板上的生長，樣品中未能檢測到金黃色葡萄球菌，但在白腐乳和臭腐乳樣品中檢測到金黃色葡萄球菌腸毒素A?？梢?，運用純培養法對于腐乳中微生物菌群的認識有一定的局限性。

利用PCR-變性梯度凝膠電泳技術，比較不同品牌腐乳細菌多樣性，發現乳酸桿菌屬是腐乳中細菌的優勢菌群[35]。耿予歡等[36]建立了不依賴純培養的腸桿菌基因間重復一致序列-PCR技術，監測了腐乳發酵過程中微生物群落結構變化。上述兩種方法雖然彌補了傳統純培養法的缺陷，但是均依賴于電泳技術，結果重現性相對較低。

高通量測序技術不僅能夠快速地分析復雜微生物群落多樣性，還能檢測到低存在率以及不可培養的微生物。劉亞棟[37]利用高通量測序分析菌屬發現同一品牌的紅、白和青腐乳之間細菌組成具有較大的差異性。Huang Xiaoning等[38]利用Illumina MiSeq高通量測序平臺發現腸桿菌屬、不動桿菌屬、乳球菌屬是紅腐乳發酵生產過程中的主要優勢菌屬。

本研究利用高通量測序技術對不同地區紅腐乳中細菌多樣性進行分析。從屬水平上菌群結構分布可知，不同地區的腐乳中細菌的多樣性存在差異。華東地區的腐乳主要優勢菌屬為明串珠菌屬、乳球菌屬以及四聯球菌屬；芽孢桿菌屬則是東北地區紅腐乳的主要優勢菌屬；此外，魏斯氏菌屬、梭菌屬則分別是華東地區（江蘇?。|北地區（黑龍江省）所特有的菌屬。

對9 種紅腐乳細菌群落結構進行主成分分析，發現同一地區的紅腐乳樣品中菌群存在一定的聚類關系。目前，我國腐乳生產發酵依據豆腐坯培菌的菌種不同，可分為毛霉型、根霉型和細菌型[39]，如R8樣品是采用藤黃微球菌（Micrococcus luteus）進行發酵的細菌型腐乳，使得菌群結構不同于其他東北地區的樣品，兩個東北地區樣品菌群結構距離較遠。由于腐乳的生產過程多為開放式生產，且多為傳統的手工操作，生產車間空氣、主要接觸面以及生產過程中的原輔料中的微生物均會對最終的產品產生影響[7]，使得每個廠家的腐乳中微生物菌群具有一定的獨特性，這可能是R1樣品與其他華東地區樣品離散的原因；而R2樣品中還添加了玫瑰花作為輔料，玫瑰花中的微生物在后發酵過程中影響了該樣品的菌群結構。

4 結 論

本研究通過高通量測序技術對不同地區紅腐乳中細菌多樣性進行分析，對其中優勢菌群組成進行了初步分析。結果發現，本次測序深度有效地覆蓋了樣品中微生物種類，不同地區紅腐乳樣品中細菌群落結構具有豐富多樣性。在門水平上，厚壁菌門、放線菌門和變形菌門為紅腐乳中主要的門；而在屬水平上，不同地區紅腐乳樣品中優勢菌在種類及相對分布上有較大的差異，明串珠菌屬、乳球菌屬以及四聯球菌屬為華北地區樣品中主要的優勢菌屬，而東北地區腐乳樣品中的芽孢桿菌屬和鹽厭氧菌屬為主要的優勢菌屬。