同位素稀釋超高效液相色譜-串聯質譜法測定人血清中孕酮

薛晉美，孫 光，李會強，那 平，喬 斌*

(1.天津大學 化工學院，天津 300350；2.天津市公安醫院檢驗科，天津 300042；3.天津醫科大學 檢驗學院，天津 300203)

孕酮(Progesterone)又稱黃體酮，是一種具有重要生物活性的類固醇激素，其在非孕期女性體內主要由卵巢黃體分泌，孕期女性主要由胎盤分泌，在內分泌、生殖、經期過程方面起關鍵調控作用。其在男性體內主要在促腎上腺皮質激素調控下由腎上腺分泌[1]。作為一種神經類固醇，孕酮在大腦神經方面也有重要的信號調節功能[2]。成年女性血清中的孕酮濃度通常在0.15～25 ng/mL之間，孕期約升高至230 ng/mL[3]；男性和更年期女性體內的孕酮濃度較低，在1～3 nmol/L之間[2]。血清中的孕酮大多以蛋白結合形式存在，游離孕酮占總孕酮濃度的比例在2%～10%之間變化，但在正常經期女性體內游離孕酮的比例保持恒定[3]。血清中孕酮的準確測定對于黃體功能、宮內妊娠、自然流產等的確認以及其它疾病的診斷具有重要的臨床意義。

放射免疫測定(RIAs)和酶聯免疫吸附測定(ELISAs)是最常用的激素測定方法[4]。免疫法的靈敏度高，但由于抗體的交叉反應、基質干擾等因素會存在準確性差[5-7]、動態范圍窄[8]等缺陷。此外，孕酮等類固醇激素的檢測方法還有氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)和液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)[9-12]。人血清中孕酮的臨床檢測早期采用同位素稀釋氣相色譜-質譜法(ID GC-MS)，但需進行復雜的衍生化且分析時間較長[13-14]。隨著質譜技術的發展，同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法(ID LC-MS/MS)因具有靈敏度高、特異性強、樣品處理簡單等優點，目前被認為是臨床檢測和研究的首選方法。LC-MS/MS法已被開發用于血清中孕酮的分析[15-17]。美國國家標準研究院(NIST)建立了血清中孕酮的ID LC-MS/MS參考方法[3]，該法準確可靠，但LC梯度洗脫時間為40 min，分析時間大大加長。

本研究建立了一種利用同位素稀釋超高效液相色譜-串聯質譜(ID UPLC-MS/MS)檢測血清中孕酮濃度的方法。采用兩步萃取法,提高了血清樣品中孕酮的回收率;使用簡單的液相色譜分離，運行時間短，靈敏度高，重現性好。該方法適用于同時檢測大批量樣品，為臨床血清中激素的檢測提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity 超高效液相色譜儀、Xevo TQ-XS 三重四極桿串聯質譜儀(美國Waters公司)；渦旋混合儀(MS 3 basic，德國IKA公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；氮吹儀(艾杰爾飛諾美公司)；分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)；可調量程移液器(0.5～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL，德國Eppendorf公司)；Milli-Q Reference超純水系統(美國Millipore 公司)。

孕酮標準品(99.2%，中國計量科學研究院)；孕酮-D9同位素標準品(98%，美國CFW實驗室);甲醇(HPLC級，德國Merck公司)；正己烷、乙酸乙酯(HPLC級，天津康科德科技有限公司)；30%氨水(LC-MS級，美國Waters公司)；乙酸銨、碳酸鈉(優級純，福晨化學試劑有限公司)；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 樣品來源

血清樣品來自天津市公安醫院門診及住院患者，樣本的收集及使用已取得醫院許可并符合相關規定，患者血清樣本共30例，外觀澄清，無溶血、黃疸及脂血，于-80 ℃冷凍保存。

1.3 標準溶液的配制

分別準確稱取適量(精確至10.00 mg)的孕酮和孕酮-D9標準物質，用甲醇配制成質量濃度為1.0 μg/mL的標準儲備液和內標儲備液，-20 ℃保存。

準確移取適量內標儲備液，用甲醇稀釋成10 ng/mL的同位素內標工作溶液，-20 ℃保存。

準確移取適量孕酮標準儲備液，用甲醇稀釋成質量濃度分別為10、25、50、100、250、500、1 000、2 500、5 000、10 000 pg/mL的系列標準工作溶液；將10 μL同位素內標工作溶液加入100 μL各系列標準工作溶液中，-20 ℃保存。

1.4 樣品制備

移取10 μL孕酮-D9內標工作溶液至1.5 mL離心管中，用氮氣將溶劑吹干，在離心管中分別加入100 μL血清樣品和100 μL乙酸銨(0.5 mol/L)，并在室溫下平衡1 h；用500 μL乙酸乙酯-正己烷(體積比3∶2)進行液液萃取(LLE)，渦旋振蕩10 min，13 000 r/min離心2 min后，取上清液以40 ℃氮氣吹干；向離心管中加入200 μL碳酸鈉(0.2 mol/L)，再依次加入500 μL正己烷萃取2次，13 000 r/min離心5 min后，合并兩次提取上清液，以40 ℃氮氣吹干，加100 μL甲醇進行復溶，待上機分析。

1.5 UPLC-MS/MS測定條件

1.5.1 色譜條件Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm；美國Waters公司)；流動相：A為0.1%(體積分數)氨水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，40%B；0.5～2.5 min，40%～10%B；2.5～3.5 min，10%B；3.5～3.6 min，10%～40%B；3.6～5.0 min，40%B。流速：0.4 mL/min，柱溫：45 ℃；自動進樣器溫度：4 ℃；進樣量：5 μL。

1.5.2 質譜條件電噴霧(ESI)離子源，正離子模式；多反應監測(MRM)掃描模式；毛細管電壓為3.0 kV；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣(高純N2)：溫度為500 ℃，流量為1 000 L/h；錐孔反吹氣(高純N2)流量為150 L/h；碰撞氣為高純Ar。目標物的監測離子對(m/z)、錐孔電壓、碰撞電壓等質譜參數見表1。

表1 孕酮及其同位素的質譜分析條件Table 1 Optimized MS/MS parameters for progesterone and progesterone-D9

2 結果與討論

2.1 樣品處理方法的優化

血清樣品常用的前處理方法包括蛋白沉淀、固相萃取(SPE)、LLE萃取等。孕酮的質譜檢測文獻中，大多采用正己烷對樣品進行LLE萃取[3,15-16]。為有效去除脂質干擾，本實驗采用兩步LLE萃取對樣品進行凈化，第一步使用乙酸乙酯-正己烷(3∶2)對孕酮進行提取；第二步加入碳酸鈉去除樣品中的極性脂質物質，再用正己烷反復萃取2次。該凈化步驟有效降低了雜質干擾，提高了血清樣品中孕酮的回收率。同時，由于用甲醇作溶劑，內標溶液的加入會使血清蛋白局部產生沉淀，為消除沉淀的影響，本實驗在加樣前用氮氣將溶劑吹干。以乙酸銨作解離劑能將孕酮與結合蛋白完全解離，同時避免了內標物與蛋白的結合，消除內標物與分析物回收率的不完全平衡，從而使分析物的回收率趨于一致，提高檢測的精密度。優化后的處理方法，可使樣品的絕對回收率達到80%。

2.2 流動相的選擇

首先考察了甲醇和乙腈作為流動相時的分離效果和響應信號，結果顯示采用乙腈為流動相時，孕酮和孕酮-D9的峰形較差，保留時間靠前；甲醇為流動相時的背景干擾小，孕酮和孕酮-D9均能獲得理想的峰形，且響應信號明顯較乙腈作為流動相時高，這可能是由于甲醇作為流動相時待測物的離子化效率更高，因此選擇甲醇-水作為流動相。另比較了0.1%氨水溶液和10 mmol/L乙酸銨溶液兩種水相溶液與甲醇組合的流動相體系的分離效果和靈敏度，發現以0.1%氨水溶液作水相時，孕酮的響應值較高，分離效果和靈敏度較好。因此，流動相確定為0.1%氨水溶液和甲醇。在“1.5”條件下，孕酮和同位素標準品的MRM色譜圖見圖1。

圖1 孕酮及同位素標準品的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of progesterone and progesterone-D9 standards

2.3 方法學評價

2.3.1 基質效應基質效應(ME)是指樣品中的背景雜質對目標物質譜信號的影響(增強或抑制)，通常通過比較目標物在基質和空白溶劑中的響應信號進行評價[16]。用空白溶劑(甲醇)分別配制低、中、高質量濃度(0.05、0.5、5.0 ng/mL)的標準溶液并添加內標工作溶液，提取制得標準溶液a；取真實血清樣品，分別添加低、中、高質量濃度水平的孕酮標準溶液及10 μL內標工作溶液(10 ng/mL)，提取制得基質樣品b；取相同的血清樣品添加內標工作溶液，提取制得基質對照樣品c。對樣品和標準溶液進行質譜測定，參照Botelho方法[18]進行計算，ME%=(Rb-Rc)/Ra×100%，其中R為樣品或標準溶液中孕酮和內標響應信號的比值。一般認為，當ME值接近100%時，表明不存在基質效應的影響。結果顯示本方法的ME平均值為95.20%，表明樣品基質對孕酮的質譜響應無明顯影響。

2.3.2 線性關系、檢出限與定量下限采用同位素內標法進行定量，取“1.3”系列標準工作溶液各100 μL,加入10 μL孕酮-D9內標工作溶液，在優化條件下進行測定，以標準溶液定量離子峰面積與內標物定量離子峰面積的比值(y)為縱坐標，標準溶液的質量濃度(x,pg/mL)為橫坐標進行線性回歸，并計算血清中待測物的濃度。結果顯示，孕酮在10～10 000 pg/mL質量濃度范圍內線性關系良好(r2=0.999 8)，回歸方程為y=1.104x+34.013；系列標準溶液中內標物定量離子的峰面積穩定，RSD為7.9%。按信噪比(S/N)為3的質量濃度確定檢出限(LOD)為5 pg/mL，S/N為10的質量濃度確定定量下限(LOQ)為10 pg/mL。

2.3.3 回收率與相對標準偏差取10 μL內標工作溶液于1.5 mL離心管中，加入0.1 mL空白血清基質，分別配制低、中、高3種質量濃度(0.05、0.5、5.0 ng/mL)的質量控制(QC)樣品。每個濃度平行制備6份，按照本方法進行提取與測定，并計算平均回收率和日內RSD;連續測定3 d，計算日間 RSD。結果表明，孕酮的平均回收率為91.5%～106%，日內RSD和日間RSD均在10%以內(表2)，符合生物樣品分析要求。

表2 血清中孕酮的回收率及精密度Table 2 Recoveries and precisions of progesterone in serum

2.3.4 樣品穩定性制備低、中、高3種質量濃度水平(0.378、4.510、5.872 ng/mL)的血清樣品，分別考察了其在室溫下放置4 h、樣品提取后提取物于4 ℃儲存24 h、3個凍融循環后的穩定性。以6次測定的平均值為樣品實際濃度，結果顯示孕酮的響應值變化低于15%，表明樣品在以上3種條件下均可穩定儲存。

2.4 臨床血清樣品的檢測

采用本文建立的分析方法，對采集的30例真實血清樣品進行檢測。結果顯示，所有樣品均檢出孕酮，質量濃度為0.050 2～1.363 5 ng/mL，均在正常生理范圍內，表明所測血清樣品的來源個體生理表現健康。

3 結 論

本文建立了檢測人血清中孕酮的UPLC-MS/MS法，對于基質極其復雜的血清樣品采用兩步液液萃取法，增加了提取效率，極大提高了方法靈敏度。該方法無需衍生化，樣品制備簡單；且以同位素為內標，提高了方法準確度，具有較高的實用性，可用于臨床血清樣品檢測。