高效液相色譜/蒸發(fā)光散射法測定多黏菌素類原料藥中主成分含量

彭侃霖，宋旭琴，劉 戎，張嘉慧，周 豪，丘鏡莉，賀利民

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室，廣東 廣州 510642)

多黏菌素類(Polymyxins)藥物是從多黏芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)中提取的非核糖體途徑合成的環(huán)多肽類抗生素，主要包括A、B、C、D和E等品種[1]。其中，多黏菌素B主要成分為多黏菌素B1和B2；多黏菌素E(Colistin，又稱克利斯汀)主要成分為多黏菌素E1和E2(圖1)。多黏菌素類抗生素對革蘭氏陰性桿菌(如大腸桿菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌等)具有較強的抗菌作用，如多黏菌素E作為獸藥廣泛應(yīng)用于治療呼吸道、腸道和泌尿系統(tǒng)感染等疾病[2]。此外，多黏菌素E還具有提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進動物生長的作用，曾被農(nóng)業(yè)部列為可在牛、豬和雞飼料中添加使用的藥物添加劑[3]。但其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的廣泛、大量和長期使用，不僅具有潛在腎毒性及神經(jīng)毒性作用，還會增大細菌耐藥性風(fēng)險，危害人類健康[4-6]。為此，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2428號公告明確規(guī)定停止多黏菌素E用于動物促生長，但保留其在動物中的藥用功能[7]。

圖1 多黏菌素B和多黏菌素E的結(jié)構(gòu)式
Fig.1 Chemical structures of polymyxin B and polymyxin E

多黏菌素B和E均由相應(yīng)生產(chǎn)菌發(fā)酵后提取制備，組分復(fù)雜，對其產(chǎn)品質(zhì)量保證和控制具有較高要求。目前，飼料及飼料添加劑中多黏菌素B和E的檢測主要有微生物檢測法[8]、毛細管電泳法[9]及高效液相色譜法[10](High performance liquid chromatography，HPLC)。《中華人民共和國藥典》2015年版[11]則采用抗生素微生物檢定法，但其操作步驟多，環(huán)境潔凈度要求較高，且測定結(jié)果重復(fù)性差[12]，難以體現(xiàn)實際效價。朱曦等[13]建立了高效液相色譜/紫外檢測法(High performance liquid chromatography ultraviolet detection，HPLC/UVD)測定硫酸黏菌素多種劑型中多黏菌素E的含量，但因多黏菌素類藥物紫外吸收較弱，需在遠紫外區(qū)測定，結(jié)果易受其他雜質(zhì)影響。Kimura等[14]建立了間接熒光法分離測定多黏菌素類藥物，但需增加衍生步驟，操作難以控制，精密度不高。因此，建立快速、靈敏、可靠的檢測方法對原料藥質(zhì)量控制具有重要意義。蒸發(fā)光散射檢測器(Evaporative light scattering detector，ELSD)作為一種通用型檢測器，其響應(yīng)不依賴于化合物的光學(xué)特性，適用于檢測無光學(xué)吸收或吸收弱的物質(zhì)[15-16]。本文開發(fā)了一種分別測定多黏菌素B和多黏菌素E原料藥中各自主成分含量的HPLC/ELSD分析方法，為該類原料藥與制劑的分析和質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司),配2424蒸發(fā)光散射檢測器；AG204型精密電子分析天平(瑞士Mettler公司)；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

多黏菌素E對照品(含量84.7%，批號:P689400，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；多黏菌素B對照品(含量92.6%，批號:50410，德國Dr.Ehrenstrofer公司)；多黏菌素B原料藥1號、多黏菌素E原料藥1號和2號均購于市場；甲醇、甲酸(色譜純，美國Fisher scientific公司);乙酸銨(色譜純，美國Tedia公司)。

1.3 對照品溶液的制備

精密稱取多黏菌素B和多黏菌素E對照品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，以0.1%甲酸水溶液稀釋至刻度，超聲、搖勻，配成1 mg/mL的對照品儲備溶液。分別取0.25、0.50、1.0 mL于10 mL容量瓶中,定容，超聲，配成25、50、100 μg/mL的對照品工作液，備用。

1.4 供試品溶液的制備

分別精密稱取13.2 mg多黏菌素B(標示含量為75.6%)和11.0 mg多黏菌素E(標示含量為90.5%)供試品，置于10 mL容量瓶中，用初始比例流動相稀釋至刻度，超聲處理5 min，以流動相定容，混勻，配成1 mg/mL溶液后，按“1.3”方法稀釋配成25、50、100 μg/mL的供試品溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex Biphenyl column(50 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)；流動相：A為甲醇，B為20 mmol/L乙酸銨(含0.6%甲酸)。多黏菌素B梯度洗脫程序：0～1 min，15%A；1～6 min，15%～50%A；6～9 min，50% A；9～11.5 min，50%～15% A；11.5～16.0 min，15% A。多黏菌素E梯度洗脫程序：0～1 min，15%A；1～10 min，15%～50%A；10～13 min，50% A；13～15.5 min，50%～15% A；15.5～18.0 min，15% A。流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：50 μL。ELSD參數(shù)：漂移管溫度55 ℃，載氣壓力20 psi，增益250，動力模式為冷卻模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

目前分離多黏菌素類藥物的色譜柱主要為C18柱[17]，實驗考察了Phenomenex Kinetex Biphenyl(50 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)、Waters symmetry C18(4.6 mm×250 mm i.d.，5 μm)及Elite Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm i.d.，5 μm)色譜柱對目標藥物分離度的影響。結(jié)果顯示，2種C18色譜柱均表現(xiàn)為分析物保留差、拖尾、響應(yīng)低，而Kinetex聯(lián)苯柱較C18色譜柱有更好的保留，且其分離度高、峰窄、無拖尾。另外，采用C18色譜柱分析時，通常需要在流動相中添加七氟丁酸等離子對試劑或添加高濃度磷酸溶液以增加分析物的保留、改善分析物峰形、提高靈敏度[18]，但這會損耗色譜柱性能從而降低其使用壽命。Biphenyl聯(lián)苯基色譜柱對各類化合物均具有出色的保留和色譜性能，100%水相穩(wěn)定，由雙環(huán)結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的高密度電子云可起到類似弱陽離子交換的作用，使得堿性化合物的保留增強，其對多黏菌素類極性化合物顯示出高選擇性和卓越的分離能力，因此本文選擇Phenomenex Kinetex Biphenyl(50 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)色譜柱進行實驗。

2.2 流動相的選擇

采用ELSD檢測時，在選擇揮發(fā)性流動相前提下，實現(xiàn)對大分子多黏菌素類極性化合物的有效分離和獲得高的分析靈敏度至關(guān)重要[19]。本實驗比較了甲醇或乙腈為有機相，水、甲酸水或酸化乙酸銨水溶液為水相時，對目標藥物分離度和峰形的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)僅使用典型的流動相(如乙腈-水或甲醇-水)時，待測物的分離度和峰形均不理想；添加甲酸后，目標物峰形改善，分離度和響應(yīng)值均有增加，但乙腈體系遜于甲醇體系。此外，流動相使用乙酸銨緩沖溶液可減少分析物的二次保留，改善峰拖尾問題。因此，實驗最終選擇甲醇-20 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.6%甲酸)為流動相，此條件下目標分析物峰形尖銳、分離度好、靈敏度高。

2.3 蒸發(fā)光散射檢測器條件的優(yōu)化

ELSD信號響應(yīng)只與流出物中化合物的濃度相關(guān)，適用于檢測無發(fā)色基團的藥物[20]。本文通過優(yōu)化漂移管溫度、載氣壓力及增益，以獲得最佳ELSD條件。結(jié)果表明，目標藥物響應(yīng)隨著漂移管溫度升高而增強，但溫度高于55 ℃后，藥物會由于過度霧化而響應(yīng)下降，因此選擇漂移管溫度為55 ℃；載氣壓力與流動相及化合物的揮發(fā)性有關(guān)，當(dāng)載氣壓力高于30 psi時，藥物幾乎無響應(yīng)，因此選擇最低的載氣壓力20 psi；增益為儀器響應(yīng)的放大倍數(shù)，ELSD增益增加，被測化合物的響應(yīng)值增大，但基線噪音也隨之增大，綜合考慮最終增益設(shè)定為250。在此ELSD條件下，目標化合物均能獲得良好的響應(yīng)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗在上述優(yōu)化色譜條件下，分別取同質(zhì)量濃度(100 μg/mL)的對照品溶液、供試品溶液和試劑空白溶液進樣，獲得相應(yīng)的色譜圖(圖1)，由圖可見，多黏菌素B和E各主成分分離良好，在其相應(yīng)保留時間附近無干擾峰。

圖2 多黏菌素B和多黏菌素E的液相色譜圖Fig.2 Typical HPLC chromatograms of polymyxin B and polymyxin EA.reference substance;B.the corresponding reagent blank control solution;C.sample solution

2.4.2 線性范圍、檢出限與定量下限分別準確移取多黏菌素B和多黏菌素E對照品儲備液，用初始流動相稀釋配成質(zhì)量濃度為10、20、50、100、150、200 μg/mL的標準工作液，在優(yōu)化條件下進樣測定，多黏菌素B峰面積以B1與B2峰面積之和計，多黏菌素E峰面積以E1與E2峰面積之和計。經(jīng)蒸發(fā)光散射檢測器檢測獲得ELSD色譜圖，以質(zhì)量濃度的對數(shù)(x)為橫坐標，峰面積對數(shù)(y)為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果顯示，多黏菌素B和E在10～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程分別為y=0.634 5x-1.942(r=0.998 8)和y=0.568 9x-1.525(r=0.999 5)。以3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的質(zhì)量濃度計算得檢出限(LOD)分別為0.8 μg/mL和1.2 μg/mL；以S/N=10計算得定量下限(LOQ)分別為2.6 μg/mL和4.0 μg/mL。

2.4.3 精密度準確吸取“1.3”配制的多黏菌素B和多黏菌素E對照品溶液(50 μg/mL)，在優(yōu)化條件下測定，同一天內(nèi)連續(xù)進樣6次，計算峰面積，以其相對標準偏差(RSD)表示儀器精密度。結(jié)果表明，多黏菌素B及多黏菌素E對照品峰面積的RSD分別為1.2%和1.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 回收率實驗分別準確移取1 mg/mL對照品溶液各0.20、0.50、1.0 mL于10 mL容量瓶中，加入“1.4”配制的1 mg/mL供試品溶液0.25 mL，用初始比例流動相定容至刻度，搖勻、超聲，分別配成低、中、高3個添加濃度，每個濃度配制3份，連續(xù)測定3批次。分別計算同一批(n=3)和3批次(n=9)的平均回收率及RSD。結(jié)果顯示，多黏菌素B和多黏菌素E在3個添加濃度下的批內(nèi)回收率分別為100%～104%和101%～103%，批內(nèi)RSD分別為0.90%～2.4%和0.90%～2.6%；批間回收率分別為101%～103%和101%～102%，批間RSD分別為1.1%～1.9%和1.3%～1.7%。該方法準確、可靠，完全滿足藥物含量分析的精密度和回收率要求。

2.4.5 穩(wěn)定性取多黏菌素B原料藥1號與多黏菌素E原料藥1號供試品溶液(50 μg/mL)，分別在0、2、4、8、12、16、24 h進樣測定，并計算各待測物峰面積。結(jié)果顯示，多黏菌素B與多黏菌素E峰面積的RSD分別為0.7%與0.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 實際樣品檢測

取多黏菌素B-1號和多黏菌素E-1號、E-2號原料藥樣品，采用本方法在優(yōu)化條件下處理并測定；并用滅菌生理鹽水分別配制多黏菌素B和多黏菌素E供試品溶液和對照品溶液，按照《中國獸藥典》2015版和《中國獸藥質(zhì)量標準》2017年版微生物檢定法中的比濁法測定溶液的OD(光密度)值，通過計算得到供試品藥物含量，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，本方法與微生物檢定法測定結(jié)果相差不大，但本方法的RSD明顯低于微生物檢定法。

表1 高效液相色譜/蒸發(fā)光散射法與微生物檢定法測定結(jié)果比較(n=3)Table 1 Comparison of the results obtained from HPLC/ELSD and microbial assay(n=3)

3 結(jié) 論

本研究首次建立了高效液相色譜/蒸發(fā)光散射法用于多黏菌素B及多黏菌素E原料藥中主成分含量的測定，該方法快速、準確、重現(xiàn)性好，與傳統(tǒng)的微生物檢定法測定結(jié)果相當(dāng)，且精密度更高，可用于多黏菌素B和多黏菌素E兩種原料藥的質(zhì)量控制。